论文摘要
目的本研究观察细胞凋亡抑制蛋白2（cell inhibitor of apoptosis protein 2,C-IAP2）在胰腺癌组织以及胰腺癌细胞中的表达情况并分析其与病理分级、临床分期之间的关系,并进一步阐明C-IAP2的表达与吉西他滨化疗促胰腺癌凋亡作用和胰腺癌吉西他滨化疗耐药的关系。方法1.收集本院普通外科2005年8月至2008年3月手术切除的胰腺癌组织标本32例,癌旁正常胰腺组织标本18例,运用免疫组织化学染色方法观察C-IAP2在胰腺癌组织以及癌旁正常胰腺组织的表达情况,分析C-IAP2的表达水平与胰腺癌组织的病理分级和临床分期之间的关系。Western blot进一步观察C-IAP2在低分化的胰腺癌PANC-1细胞、中分化的胰腺癌AsPC-1细胞、高分化的胰腺癌BxPC-3细胞中的表达情况,分析C-IAP2的表达水平与胰腺癌细胞的病理分级之间的关系。2.研究吉西他滨体外诱导人胰腺癌PANC-1细胞凋亡作用和分子机理,MTT比色法测定细胞增殖活性,透射电子显微镜观察凋亡细胞形态,AnnexinV-PI双标记法流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR分析细胞C-IAP2的mRNA表达,Western blot法检测不同浓度吉西他滨作用后C-IAP2、第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂（second mitochondria-derived activator of caspase,Smac）、Bcl（B cell lymphoma）-2和Bax的表达变化,分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9活性。3.采用间歇浓度梯度递增法诱导胰腺癌PANC-1细胞株对吉西他滨耐药,检测其生物学性状变化,免疫荧光和免疫印迹法对比观察C-IAP2活性变化。结果1.C-IAP2在胰腺癌组织均有表达（32/32,100%）、癌旁正常胰腺组织（8/18,44.4%）中有表达,胰腺癌组织中表达水平显著强于癌旁正常胰腺组织。C-IAP2的表达强度在不同分化程度的肿瘤组织中的差异有统计学意义（P <0.05）。C-IAP2在低分化的胰腺癌细胞PANC-1中呈高表达,而在中分化和高分化的胰腺癌细胞AsPC-1和BxPc-3中表达较低（P <0.05）。2.MTT比色法测定显示:吉西他滨抑制人胰腺癌细胞株PANC-1增殖,呈浓度依赖性;其IC50值为5.79ug/ml。AnnexinV-PI双标记法FCM分析、透射电子显微镜观察的结果证实:吉西他滨具有诱导人胰腺癌PANC-1细胞株凋亡作用。RT-PCR分析发现吉西他滨能显著下调PANC-1细胞C-IAP2的mRNA表达,Western blot分析发现吉西他滨能显著下调胰腺癌细胞PANC-1的C-IAP2、Bcl-2蛋白表达水平,上调Smac、Bax蛋白表达水平,分光光度法分析发现吉西他滨作用后胰腺癌PANC-1细胞的Caspase-3、Caspase-9活性显著升高。3.药物培养3个月后,得到稳定传代的PANC-1/Gem耐药细胞株,其形态学、生长特征等均发生了明显变化,细胞变圆、体积缩小、颗粒样物质增多及细胞倍增时间延长,对吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿霉素和丝裂霉素的耐药性均显著增加;耐药细胞PANC-1/Gem的C-IAP2的蛋白表达水平也明显增高。结论1.C-IAP2在胰腺癌组织中的表达水平以及阳性率均显著高于癌旁的正常胰腺组织,推测C-IAP2的表达升高可能在胰腺癌的发生中起一定作用。C-IAP2的表达强度在不同分化程度的肿瘤组织和细胞中的差异有统计学意义,通过检测术后组织标本中C-IAP2的表达有可能对胰腺癌的恶性程度作出预测。2.吉西他滨可诱导人胰腺癌细胞PANC-1凋亡,作用与其下调凋亡抑制因子C-IAP2、Bcl-2表达水平,上调促凋亡因子Smac、Bax表达水平,活化Caspase- 3、Caspase-9有关。3.间歇浓度梯度递增法可诱导胰腺癌PANC-1细胞株对吉西他滨耐药,PANC-1/Gem有多药耐药现象,C-IAP2在耐药过程中起一定作用。
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