论文题目: 八肋游仆虫中心蛋白的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 贺晓静
导师: 梁爱华,饶子和
关键词: 八肋游仆虫,中心蛋白,性质分析,免疫荧光定位
文献来源: 山西大学
发表年度: 2005
论文摘要: 微管组织中心（MTOC）组织真核生物细胞中微管的数量,方向和极性。MTOC复制缺陷将阻断双极纺锤体的形成,使细胞分裂终止在G2/M期,相反,过量的MTOC又会导致癌症的产生。MTOC中含有大约150-200种蛋白,中心蛋白（centrin）是其中之一。中心蛋白是一种约19.5 kDa的酸性钙结合蛋白,属于钙调蛋白超家族。中心蛋白广泛存在于真核生物中,如藻类、酵母、原生动物、高等植物、哺乳动物等。这种蛋白的高保守性和在生物界的普遍存在表明它对于正常细胞的功能是必不可少的。中心蛋白参与了MTOC的复制和分裂,它的突变和缺失会导致细胞的异常分裂。中心蛋白还在依赖于它的纤维系统的收缩中起重要作用。 原生动物八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）是一种进化上处于特殊地位的单细胞真核生物,这类生物中无典型的中心粒和中心体存在,细胞分裂时纺锤体的微管由核液（Karyolymph）中的微管组成中心形成。对这类生物的中心蛋白的研究,有助于阐明低等真核生物的细胞分裂、细胞运动等重要生命活动过程的本质。本研究以八肋游仆虫为材料,克隆了该生物的中心蛋白基因（EoCen）。序列分析表明,该基因全长690 bp,两端为端粒序列C4A4C4A4C4A4C4,开放阅读框有507bp,编码168个氨基酸,不含内含子。将全长和N端截短型中心蛋白基因连入表达载体,构建了两个重组表达质粒pGEX-6p-EoCen和pGEX-6p-EoCenN,在大肠杆菌中获得了高效可溶性表达,经过GST亲和层析和Mono Q离子交换层析两步纯化后,获得了纯度达95%以上的重组游仆虫中心蛋白,每升LB培养液可以得到纯蛋白约10mg左右。 通过凝胶排阻层析分析了游仆虫中心蛋白的聚合特性,发现盐离子对它结构的变化起很重要的作用。当有盐离子存在时,中心蛋白大部分以拉长的纤维状的单体结构存在,不含盐离子的蛋白随着pH的增高,聚合程度逐步增强。加钙离子与否对有盐离子存在的蛋白没有很大的影响,但没有盐离子的蛋白中如果加入钙离子,会引起蛋白的急剧沉降。N端缺失23个氨基酸的截短体则没有这一现象发生,表明N端对中心蛋白的聚合起重要作用。在中心蛋白的紫外、荧光光谱性质分析中,发现Ca2+与apoEoCen结合时引起了蛋白构象的变化,且优先占据中心蛋白的第Ⅲ
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 综述
§1 微管组织中心(MTOC)
1.1 MTOC在细胞内不同形态和分布
1.2 MTOC的功能
1.3 MTOC的化学组成
1.4 中心体的复制和分离
§2 中心蛋白的结构基础—EF手性结构及钙调蛋白
§3 中心蛋白的结构
3.1 中心蛋白的一，二级结构
3.2 中心蛋白的三级结构
§4 中心蛋白的功能
4.1 绿藻中心蛋白功能的研究
4.2 酵母中心蛋白功能的研究
4.3 哺乳动物细胞中心蛋白功能的研究
4.4 高等植物中心蛋白功能的研究
4.5 原生生物中心蛋白功能的研究
§5 中心蛋白的作用机制
§6 实验材料——八肋游仆虫
§7 纤毛虫分子生物学研究的优势和意义
第二章 八肋游仆虫中心蛋白基因的克隆与序列分析
§1 引言
§2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 主要试剂的配制
2.3 实验方法
§3 实验结果
3.1 八肋游仆虫中心蛋白基因片段的扩增与克隆
3.2 八肋游仆虫中心蛋白全基因序列分析
§4 讨论
4.1 八肋游仆虫中心蛋白基因的扩增
4.2 八肋游仆虫中心蛋白的分类地位
第三章 八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及鉴定
§1 引言
§2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 主要试剂的配制
2.3 实验方法
§3 实验结果
3.1 表达载体的构建
3.2 重组菌的诱导表达
3.3 EoCen表达的Western blotting鉴定
3.4 表达蛋白的纯化
§4 讨论
4.1 关于中心蛋白的可溶性分析
4.2 重组蛋白的纯化
第四章 八肋游仆虫中心蛋白聚合特性的初步分析
§1 引言
§2 材料与方法
2.1 材料
2.2 实验方法
§3 实验结果
3.1 表观分子量的测定
3.2 pH及盐的影响
3.3 Ca~(2+)的影响
3.4 化学交联分析
3.5 Western Blotting分析
§4 讨论
第五章 八肋游仆虫中心蛋白的光谱学研究
§1 引言
§2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 实验方法
§3 实验结果
3.1 中心蛋白的紫外光谱，荧光光谱和CD光谱
3.2 盐离子浓度对EoCen CD谱的影响
3.3 pH对EoCen CD谱的影响
3.4 温度对EoCen CD谱的影响
3.5 Ca~(2+)与apoCen结合的紫外差光谱研究
3.6 不同浓度Ca~(2+)对EoCen内源荧光光谱的影响
3.7 Ca~(2+)对EoCen CD谱的影响
§4 讨论
4.1 EoCen是个稳定的蛋白
4.2 Ca~(2+)对EoCen的作用
第六章 八肋游仆虫中心蛋白晶体的生长及X射线衍射
§1 引言
§2 蛋白质结晶学的原理和方法
2.1 蛋白质结晶
2.2 相位问题
§3 材料与方法
3.1 实验材料
3.2 实验方法
§4 实验结果
4.1 EoCen结晶条件的摸索
4.2 EoCen晶体的X射线衍射
§5 讨论
5.1 晶体的生长
5.2 晶体结构的解析
第七章 中心蛋白在八肋游仆虫细胞中的定位
§1 引言
§2 材料与方法
2.1 材料
2.2 实验方法
§3 实验结果
3.1 EoCen抗血清的效价检测
3.2 EoCen的Western blotting分析
3.3 免疫荧光定位
§4 讨论
总结与展望
参考文献
致谢
附录Ⅰ
附录Ⅱ
承诺书
发布时间: 2005-08-31
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