重组靶向毒素DLM-S3的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

论文摘要

癌症是一种细胞异常增殖引起的疾病，对人类的健康造成严重的危害。针对癌症的治疗主要有：手术切除、放射治疗和化学治疗等。癌细胞能够通过血液或淋巴转移，使得手术难以彻底清除；放射治疗具有一定的局限性；化疗药物缺乏对肿瘤细胞的杀伤特异性，对机体正常组织造成损伤，且多次治疗后易产生耐药性。随着肿瘤生物学的发展，肿瘤发生发展的机制逐渐明确，人们对肿瘤的治疗策略发生改变，靶向治疗逐渐成为研究的热点。靶向药物主要由三个部分组成：导向载体，效应分子（弹头）和二者的连接。导向载体能与肿瘤细胞表面的分子特异性结合，选择性地将效应分子运送至肿瘤组织处，发挥杀伤作用，降低对正常组织的毒副作用。目前靶向药物的应用出现了一些问题，例如：导向载体与肿瘤细胞结合的特异性不强，接头的不稳定性，效应分子的空间构象受到影响等。针对上述问题，本研究设计了一种导向毒素，其特异性强，毒副作用小，能够在肿瘤组织处通过可裂解接头释放效应分子，发挥效应分子的杀伤作用。整合素是一类细胞表面粘附分子，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。其中的αvβ3在肿瘤组织新生血管内皮细胞高表达，但是在成熟的血管内皮细胞和大数正常组织中低表达或不表达。这些特性使其成为靶向药物作用的一个理想靶点。本研究利用能与整合素αvβ3发生特异性结合的蛇毒去整合素作为导向载体。αvβ3识别其配体蛋白的位点是RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列，我们选取的乌苏里蝮蛇去整合素与αvβ3的结合能力较RGD序列强2000多倍。这种高效、特异性的结合能将效应分子选择性地在肿瘤组织处富集，而在正常组织中浓度较低，降低了毒副作用。我们选择的效应分子是蜂毒肽，由26个氨基酸组成。在低浓度、低离子强度时为单体结构，在高浓度、高离子强度下能够自我交联形成α-螺旋结构的四聚体。蜂毒肽的α-螺旋具有两亲性，使其既能够溶于水又能与细胞膜发生作用。导向载体将其运送至肿瘤细胞表面后，能直接与细胞膜发生作用，使内容物外漏，引起细胞死亡。uPA是一种丝氨酸蛋白酶，在多数肿瘤细胞中高表达。其主要功能是参与基底膜的分解与再生，与肿瘤的转移关系密切。其受体uPAR能与玻连蛋白结合，形成αvβ3-玻连蛋白-uPAR复合体。uPA与uPAR结合后活性增强。这样在肿瘤细胞表面αvβ3处富集了大量高活性uPA。我们在导向载体和效应分子间插入uPA识别序列，当导向载体与肿瘤细胞表面αvβ3结合后，通过uPA将效应分子释放出来，对附近的肿瘤细胞产生杀伤作用。uPA的生理底物序列为PGRVV，我们选择的uPA切割序列LGGSGRSAV是根据其最佳识别序列优化而来，其切割效率较生理底物序列高5000多倍。综上所述，我们以乌苏里蝮蛇去整合素为导向载体，以蜂毒肽为效应分子，在二者间引入连接肽序列SGGGSGGGSGGGS和uPA切割序列，设计了重组导向毒素DLM-S3。本研究构建了毕赤酵母真核表达载体pPIC9K/DLM-S3，将其用内切酶sacⅠ线性化后电转化酵母菌株GS115，通过组氨酸缺陷筛选出阳性转化子，提取转化子基因组DNA进行PCR验证。通过G418抗性筛选来获得目的基因高拷贝数的转化子，经1%甲醇诱导表达96h后表达量达到峰值。15%SDS-PAGE电泳分析发酵上清液，在15kDa附近出现特异性条带，表明目的蛋白DLM-S3成功通过毕赤酵母分泌表达。SDS-PAGE分析发酵上清液，筛选高表达DLM-S3的酵母菌株。摇瓶诱导表达96h后，收集发酵液上清，硫酸铵沉淀蛋白，透析除盐。用Ni-Sepharose6FF亲和层析法进行一步纯化，200mM咪唑将目的蛋白洗脱下来。SDS-PAGE显示为15kDa大小的单一条带，灰度扫描显示纯度在90%以上。采用MTT比色法检测DLM-S3对肿瘤细胞Hela、A549和MCF-7的增殖抑制作用，同时观察对人胚肾293细胞的抑制作用。结果显示DLM-S3在低浓度下就能起到很好的抑制肿瘤细胞的作用，随着剂量的增加呈现剂量依赖关系。其48h半数抑制浓度IC50分别为5.09μg/ml、5.48μg/ml和3.60μg/ml。镜下观察DLM-S3对三种肿瘤细胞具有直接杀伤作用，细胞形态发生变化，细胞膜被破坏，内容物释放，细胞数量减少。16μg/mlDLM-S3对293细胞抑制率仅为7.5%，对细胞生长无显著影响。溶血实验证明DLM-S3基本无溶血作用。透射电镜观察DLM-S3作用后的MCF-7超微结构，发现细胞膜破裂，胞质空泡化，细胞器消失，呈现坏死形态。综上，本研究构建了DLM-S3真核表达体系，通过Ni-Sepharose6FF亲和层析法一步纯化出重组导向毒素，体外实验证明该重组毒素对肿瘤细胞具有明显杀伤作用。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 特异性的作用靶点和导向载体
• 1.1.1 整合素
• 1.1.2 蛇毒去整合素
• 1.2 起杀伤作用的效应分子
• 1.2.1 化学药物
• 1.2.2 放射性同位素
• 1.2.3 生物毒素
• 1.3 导向载体和效应分子的连接
• 1.3.1 化学交联方式
• 1.3.2 巯基接头
• 1.3.3 酸不稳定接头
• 1.3.4 酶解接头
• 1.4 立题依据
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因的设计与合成
• 2.2.2 pPIC9K/DLM-S3 的扩增和提取
• 2.2.3 pPIC9K/DLM-S3 质粒 DNA 的线性化
• 2.2.4 毕赤酵母表达系统的构建和阳性克隆的筛选
• 2.2.5 DLM-S3 的诱导表达
• 2.2.6 DLM-S3 的纯化
• 2.2.7 DLM-S3 体外溶血实验
• 2.2.8 DLM-S3 对肿瘤细胞的抑制作用
• 2.2.9 透射电镜观察 MCF-7 细胞超微结构变化
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 目的基因的设计与合成
• 3.2 pPIC9K/DLM-S3 的扩增和提取
• 3.3 pPIC9K/DLM-S3 质粒 DNA 的线性化
• 3.4 毕赤酵母表达系统的构建和阳性克隆的筛选
• 3.5 DLM-S3 的诱导表达
• 3.6 DLM-S3 的纯化
• 3.7 DLM-S3 体外溶血实验
• 3.8 DLM-S3 对肿瘤细胞的抑制作用
• 3.9 透射电镜观察 MCF-7 细胞超微结构变化
• 3.10 讨论
• 第4章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢