论文摘要
肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,是一种渐进的病理过程,以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）增生为特征。近年来的研究表明,相对进展期的肝纤维化在去除了损伤因素后是可逆的,而在肝纤维化逆转这一过程中起关键作用的是肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的凋亡,因此,诱导肝星状细胞凋亡成为阻止肝纤维化进程的途径之一。研究显示在肝纤维化形成及恢复阶段,枯否细胞（kupffer cell,KC）发挥了双刃剑的作用。在肝纤维化进展期可促进HSC的激活,促进肝纤维化的形成;在肝纤维化恢复期,KC及活化的HSC可通过表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducingligand,TRAIL）及其他凋亡刺激因子从而促进HSC的凋亡,促进ECM的降解,从而抑制肝纤维化的形成。鉴于HSC在肝纤维化发病中的重要作用及KC对HSC可能具有的双向调节作用,本研究拟选用CCl4诱导的自愈性肝纤维化模型,研究KC在肝纤维化恢复期的促HSC凋亡作用,探讨其主要发挥作用的细胞因子TRAIL可能的HSC内信号传导通路以及来氟米特（leflunomide,Lef）对该通路的影响。研究内容主要包括以下三个部分:1.确定肝纤维化病程的进展期和恢复期分期在分别建立的8w、12w和16w由CCl4诱导的自愈性肝纤维化模型上,经动态观察肝脏的病理组织学改变,结合能够敏感反应肝纤维化程度的血清学指标（HA,HA,LN,PCⅢ,CⅣ）和组织学指标—组织羟脯氨酸含量（Hydroxyproline,Hyp）的变化,初步确定CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的进展期和恢复期:进展期为模型12w,恢复期为12w模型恢复4w。TUNEL和α-SMA双重染色显示,随着HSC的活化,HSC出现自发性凋亡,且凋亡的发生随激活进程而逐渐增加;而在肝纤维化恢复时期,随着恢复时间的延长,HSC的凋亡逐渐减少。提示由于HSC总数减少,HSC凋亡比例亦随之减少,表明活化HSC主要通过凋亡来终结其活化。RT-PCR结果表明,伴随活化HSC的凋亡,TIMP-1的mRNA的表达减少,而MMP13的mRNA的表达随恢复时间的延长没有明显改变,始终维持在一个较高的水平。提示TIMPs表达水平的下降,解除了其对MMPs的抑制作用,使MMPs的活性增加,胶原分解增加,促使已形成的ECM降解,从而逆转肝纤维化。2.探讨肝纤维化恢复期TRAIL的HSC内信号转导通路TRAIL是肿瘤坏死因子家族成员中继肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、FasL之后发现的第三个凋亡分子,其与细胞膜TRAIL受体结合从而发挥生物学作用。现已发现5种TRAIL受体,其中TRAIL-R1/DR4与TRAIL-R2/DR5含有死亡域,与TRAIL结合可诱导细胞凋亡。TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R3/DcR2及OGP不含死亡域,与TRAIL结合不能诱导细胞凋亡。同时人肝细胞表面几乎不表达TRAIL-R2/DR5受体,因此,TRAIL选择性诱导HSC凋亡的作用使其在肝纤维化的治疗中具有广阔的应用前景。本研究采用Western-blot检测肝纤维化不同时期KC中TRAIL及HSC中TRAIL-R的表达及α-SMA和TRAIL-R2免疫荧光双染结果发现,活化的HSC表达DR4和DR5,静止的HSC表达DcR1和DcR2。将不同时期HSC和KC共培养发现,KC通过TRAIL经DR5诱导共培养体系中HSC的凋亡,且活化的HSC对TRAIL介导的凋亡更加敏感。将外源性寡聚化的FLAG-TRAIL预处理恢复期的HSC发现,在肝纤维化恢复期TRAIL经线粒体通路诱导HSC凋亡。上述结果提示,在肝纤维化恢复期,KC可通过TRAIL经DR5死亡受体通过线粒体途径介导HSC的凋亡。3.探讨肝纤维化恢复期Lef对HSC内TRAIL信号转导通路的影响HSC的激活、增殖是肝纤维化发生的一个中心环节,然而诱导或促进激活的HSC凋亡可避免或减少HSC聚积,这也可能成为抗肝纤维化治疗的重要对策之一。本研究显示,Lef活性代谢物,A771726（0.01,0.1和1μmol/L）预处理可明显促进肝纤维化恢复期HSC的凋亡。进一步研究发现A771726通过下调c-FLIP及RIP的表达,活化凋亡发生的死亡受体通路及上调Bid的表达,激活线粒体通路来诱导活化的HSC凋亡。以上实验结果综合说明了诱导HSC凋亡是来氟米特在肝纤维化治疗中的又一个作用机制。