雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的实验研究

论文摘要

【研究背景】角膜移植是眼科重要的复明手术，是成功率最高的同种异体组织器官移植。在低危险植床上进行角膜移植，无其它并发症，联合局部使用免疫抑制剂，成功率高达90％；而在高危角膜移植中，排斥率仍然高达70％，免疫排斥仍是导致角膜移植失败的最主要原因。角膜移植的高危因素包括：角膜新生血管，大植片，偏中心移植以及曾接受其它组织器官移植等，其中角膜新生血管是最常见的高危因素。高危角膜移植术后，免疫排斥发生率高，临床治疗棘手，患者生活和视觉质量差，因此抑制高危角膜移植术后的排斥反应一直是眼科研究的热点。目前临床上预防和治疗高危角膜移植术后免疫排斥反应的方法有：全身和局部使用免疫抑制剂、组织配型等，最为常用的仍然是激素类药物、环孢霉素A以及他克莫司等。眼科临床迫切需要能局部应用的高效低毒的免疫抑制药物。雷帕霉素，又名西罗莫司，是1975年发现的一种抗真菌抗生素，1978年有学者发现其对于自身免疫性疾病有治疗作用，因而开始将其作为新型免疫抑制剂研究。目前雷帕霉素的研究热点主要集中在抗移植免疫排斥反应以及预防心血管支架植入术后的再狭窄等方面。研究证明全身使用雷帕霉素可以有效抑制肾脏、肝脏、皮肤以及心脏等器官移植术后的免疫排斥反应，应用于角膜移植同样有效，但是对雷帕霉素眼用剂型的研究却相对滞后，因此，我们将雷帕霉素制成滴眼剂，观察雷帕霉素滴眼剂的角膜毒性作用，研究局部应用雷帕霉素滴眼剂抑制角膜新生血管的作用，及其预防高危角膜移植排斥反应的效果，并探讨其可能的机制。第一部分雷帕霉素滴眼剂对大鼠角膜毒性的实验研究【目的】研究雷帕霉素滴眼剂对大鼠角膜的毒性，探讨雷帕霉素滴眼剂局部使用的安全浓度，为雷帕霉素滴眼剂在角膜移植中的应用奠定基础。【方法】无菌条件下将雷帕霉素溶于灭菌药用蓖麻油中，分别制成0.5％、1％以及2％浓度的雷帕霉素滴眼剂。SPF级雄性SD大鼠15只，随机分为生理盐水对照组、药用蓖麻油组、0.5％雷帕霉素组、1％雷帕霉素组及2％雷帕霉素组。各组大鼠均双眼用药，每日6次，每次1滴，连续7d。每日对大鼠角膜行裂隙灯显微镜检查并临床分级，7d后摘取角膜行组织学检查，并于透射电镜下观察角膜各层超微结构的变化。【结果】生理盐水对照组、药用蓖麻油组、0.5％雷帕霉素组以及1％雷帕霉素组角膜裂隙灯显微镜检查未见异常，临床分级为0级，组织学检查及透射电镜检查未见明显异常；2％雷帕霉素组第4日裂隙灯显微镜下见角膜轻度水肿，临床分级为1级，继续用药未见损害加重，组织学检查见角膜上皮基底细胞层排列紊乱，细胞极性消失，透射电镜见上皮层细胞间隙扩大，细胞肿胀，内皮细胞线粒体肿胀，内质网扩张，胞浆内大量糖原颗粒。【结论】结论：以蓖麻油为基质的0.5％、1％浓度雷帕霉素滴眼剂对大鼠角膜无明显毒性作用；蓖麻油作为滴眼剂基质是安全的。第二部分雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠角膜血管化的实验研究【目的】研究雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠角膜新生血管生长情况，探讨其抑制新生血管的机制。【方法】角膜缝线法建立SD大鼠左眼角膜新生血管模型12只，随机分为生理盐水对照组以及1％雷帕霉素滴眼剂组。各组均术后第1日开始用药，每日4次，每次1滴。每日行裂隙灯显微镜检查，术后第3日、7日、14日用游标卡尺测量角膜新生血管的长度，计算新生血管面积。14d后切取角膜行组织学检查，并采用免疫组织化学染色法检测血管内皮生长因子以及白介素2受体α的表达。采用SPSS10.0统计软件包分析，所得数据以((?)±s)表示，采用定量数据重复测量的方差分析，以P＜0.05表示在统计学上有显著性差异。【结果】生理盐水对照组角膜新生血管面积显著高于1％雷帕霉素滴眼剂组(F=292.507，P=0.000)；从不同时间点看，生理盐水对照组角膜新生血管面积均高于1％雷帕霉素治疗组(t值分别为11.614，8.403，12.638；P值均为0.000)。生理盐水对照组血管内皮生长因子在角膜上皮层、浅基质层、新生血管内皮、角膜缝线处上皮以及浸润的炎性细胞出现阳性表达；白介素2受体α在角膜上皮层、浅基质层、内皮、新生血管内皮、炎性浸润细胞上均有强表达。1％雷帕霉素滴眼剂组血管内皮生长因子在新生血管内皮、角膜缝线处以及浸润的炎性细胞出现阳性表达；白介素2受体α在角膜内皮、血管内皮、炎性浸润细胞上弱表达。【结论】1％雷帕霉素滴眼剂抑制角膜新生血管生长。1％雷帕霉素滴眼剂可能通过降低血管内皮生长因子的表达以及抑制炎性细胞的分化浸润从而抑制新生血管的生长。第三部分雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的实验研究【目的】研究1％雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的效果；并初步观察其与环孢素A滴眼液联合用药的效果，为临床防治高危角膜移植排斥反应提供更加合理、有效的用药方案。【方法】缝线法诱导SD大鼠左眼角膜新生血管成功后，行以Wistar大鼠为供体的穿透性角膜移植术。将手术后的受体大鼠随机分为生理盐水组、1％环孢素A组、1％雷帕霉素组以及1％环孢素A和1％雷帕霉素联合用药组，每组8只。每组均于术后第1日开始用药，每日4次，每次1滴；每日观察角膜移植物混浊、水肿以及新生血管情况，比较各组植片的存活时间。采用SPSS10.0分析。计量资料以((?)±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较当满足方差齐性要求时用LSD，如不满足方差齐性要求时用Tambane’sT2，以P＜0.05表示在统计学上有显著性差异。【结果】各组植片的平均存活时间依次为：7.9d、11.3d、13.6d、16.5d，各组角膜植片存活时间有显著性差异(F=87.372，P=0.000)，各组间比较均有显著性差异(P=0.000)。【结论】1％雷帕霉素滴眼剂延长大鼠高危角膜移植物的存活时间，且其效果优于1％环孢素A滴眼液；二者联合应用效果更好。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 雷帕霉素滴眼剂对大鼠角膜毒性的实验研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 第二部分 雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠角膜血管化的实验研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 第三部分 雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的实验研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 全文结论
• 附图
• 中英文缩略词表
• 综述
• 在读期间撰写论文情况
• 致谢
• 统计学审稿证明