养殖刺参腐皮综合症病灶处七株优势菌生理生化特性及其群体感应信号分子活性检测

论文摘要

随着国内刺参养殖业的迅速发展,养殖过程中相继出现了一系列病害问题,给刺参养殖业带来了巨大的损失。腐皮综合症因其传染性高,死亡率高而成为刺参养殖病害的研究重点。该病发病特征为:染病初期,先从口部出现感染症状,表现为围口膜松弛,触手对外界刺激反应迟钝,继而大部分刺参会出现排脏现象。中期感染的刺参身体收缩、僵直,一般口腹部出现小面积溃疡,形成蓝白色小斑点,渐渐丧失摄食能力。感染末期,病灶变大,溃疡处增多,最后导致刺参死亡,溶化成鼻涕状胶体。关于刺参疾病的研究目前国内外均处于初级阶段,一是因为刺参病害是近几年才出现的;二是因为病害发生情况随机,没有规律可循;三是发病原因和过程多种多样,有种质抗病力差、机械损伤、养殖环境不良等内外因素,使问题更加复杂化。为研究患病刺参腐皮综合症的发病机理及病灶处优势菌的性质和群体感应系统,本文以青岛某养殖场的养殖刺参为材料,对从患病刺参病灶部位分离纯化得到的七株优势菌,即:C6、4、TB、BP2、BP3、BP4、BP6,进行理化性质研究,结果表明,这七株菌生长较为迅速,TB、BP2和BP3在培养13小时左右便进入平台期;4、BP4和BP6培养19小时左右生长进入平台期;C6生长最慢,需要培养22小时后生长进入平台期。最佳培养条件为:盐度33～36%o,温度32℃左右,pH值7～8左右。抗生素敏感实验及生化指标测定的结果表明,这七株菌对氟嗪酸、氯霉素、先锋必、复方新诺明、红霉素、庆大霉素、氟哌酸等抗生素有广泛的抗性;在测试的20项生化指标中精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酶脱羧酶、脲酶、色氨酸脱氨酶、3-羟基丁酮酶均为阳性反应。通过对七株优势菌进行群体感应信号分子的提取、纯化、鉴定等方面的研究发现,菌株C6、4、TB、BP2、BP3、BP4和BP6的群体感应信号分子确实存在,但是其产生量很少,与阳性对照有鲜明的对比。AHLs是由一个可变的乙酰基链尾部与一个稳定的高丝氨酸内酯头部相连,该结构在酸性条件下最稳定,强碱可能导致高丝氨酸内酯开环,从而破坏其结构。实验表明,七株优势菌株群体感应信号分子的活性与培养基pH值的变化基本上成反比,由此推测,在偏碱性的液体中,很可能会造成信号分子的分解而降低其活性。根据相关资料显示,刺参养殖池中移植大叶藻能够大幅减少腐皮综合症的发病几率。由此推测,大叶藻中很可能含有能够拮抗AHLs的活性物质,如果能将这种活性物质提取出来,将对防治刺参腐皮综合症有积极的意义。本研究为进一步探索养殖刺参腐皮综合症的发病原因、过程和新型抗菌手段以及其它致病菌的抗感染研究提供重要的参考,在水产养殖业的抗菌感染中具有理论价值和实际意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 养殖刺参病害
• 1.1 刺参简介
• 1.2 养殖刺参病害研究现状
• 1.2.1 养殖刺参疾病的主要种类
• 1.2.2 养殖刺参病害发病原因
• 1.2.3 防治对策
• 2 细菌的群体感应（QS）系统
• 2.1 革兰氏阴性菌的QS系统
• 2.2 革兰氏阳性菌的QS系统
• 2.3 细菌用于种间交流的QS系统
• 2.4 其他QS系统
• 2.4.1.夏威夷弧菌中的双群体感应系统
• 2.4.2 LuxS/AI-2型的群体感应系统
• 2.4.3 AI-3/肾上腺素/去甲肾上腺素群体感应系统
• 3 革兰氏阴性菌信号分子（AHLS）的分离纯化与检测
• 3.1 信号分子（AHLs）的分离纯化
• 3.2 信号分子（AHLs）的生物学检测
• 3.2.1 紫色杆菌（Chromobacterium violaceum CV026）
• 3.2.2 液化肠杆菌（Serratia liquefaciens MGI）
• 3.2.3 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens NT）（Pzlr4）
• 3.2.4 生物学检测的优缺点
• 3.3 信号分子（AHLs）的性质分析
• 3.4 革兰氏阴性菌中常见的信号分子（AHLs）及其生物学功能
• 4 革兰氏阴性菌群体感应信号分子（AHLS）的干扰
• 4.1 抑制信号分子（AHLs）的生物合成
• 4.2 信号分子（AHLs）的生物灭活及降解
• 4.2.1 细菌的AHLs内酯酶
• 4.2.2 细菌的AHLs乙酰酶
• 4.3 信号分子（AHLs）的化学失活
• 4.4 信号分子（AHLs）的拮抗剂
• 4.4.1 天然及人工合成的呋喃酮类化合物
• 4.4.2 吡咯酮类化合物（pyrrinones）
• 4.4.3 取代的HSL化合物
• 4.4.4 二酮哌嗪类化合物（diketopiperazines,DKPs）
• 4.5 其他类型信号分子的拮抗剂（QSIs）
• 4.5.1 AIP类分子化合物（autoinducing peptide inhibitors）
• 4.5.2 激素类拮抗剂（hormonal mimicries）
• 4.5.3 其他类
• 5 展望
• 第二章 病灶处优势菌的生理生化特性研究
• 1 实验用品
• 1.1 菌种
• 1.2 实验仪器
• 1.3 药品与试剂
• 2 实验方法和主要试剂配方
• 2.1 理化性质研究
• 2.1.1 培养基和常用试剂配方
• 2.1.2 优势菌生长曲线的测绘
• 2.1.3 最适温度（T）、pH值、盐度的测定
• 2.2 药敏试验
• 2.2.1 实验准备
• 2.2.2 接种
• 2.2.3 贴药敏纸片
• 2.2.4 培养并判定结果
• 2.3 优势菌生化指标鉴定
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 实验所需附加试剂配方
• 2.3.3 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 理化性质研究
• 3.1.1 生长曲线的测绘
• 3.1.2 最适温度（T）、pH值、盐度
• 3.2 药敏试验结果
• 3.3 优势菌生化指标鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 养殖刺参腐皮综合症病原及病灶优势菌群
• 4.2 养殖刺参腐皮综合症可行的解决方法
• 5 小结
• 第三章 病灶处优势菌的群体感应信号分子活性检测
• 1 实验用品
• 1.1 菌种
• 1.1.1 供试菌:
• 1.1.2 报告菌株与阳性对照:
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验药品与试剂
• 1.4 培养基配方
• 2 实验方法
• 2.1 信号分子（AHLs）的提取与活性检测
• 2.1.1 准备工作
• 2.1.2 信号分子的活性检测（β-半乳糖苷酶活性法）
• 2.1.3 病原菌群体感应信号分子活性与培养液pH值的关系
• 2.2 TLC薄层层析
• 3 实验结果
• 3.1 信号分子（AHLs）的活性检测
• 3.2 待测菌各生长阶段培养液PH值与信号分子活性的关系
• 3.3 TLC薄层层析
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表学术论文