茶树叶片抗寒相关蛋白的筛选

论文摘要

植物在低温作用下由于基因表达的改变而诱发合成新蛋白质。这些新蛋白质具有高度的亲水性和热稳定性，能够保护植物细胞免受低温伤害。目前，人们对大多数植物进行了抗冷性诱导实验，均发现低温胁迫会引起植物细胞中可溶性蛋白质含量发生变化，并有特异蛋白的产生，且与植物的抗寒性密切相关。茶树叶片中蛋白质的含量约占干物重的25%，其中大部分存在于细胞质中或与膜不紧密结合，可以用极性溶剂（如水、稀酸、稀碱或稀盐溶液）进行提取，这部分蛋白质统称为可溶性蛋白质，包括热稳定和热不稳定蛋白质，主要为各种酶及一些生理活性蛋白。茶树在受到低温胁迫时，其叶片组织细胞会以分解组蛋白或是其他物质转化的方式积累大量可溶性蛋白，用此方式来增加细胞液的浓度从而降低细胞液的冰点以抵抗低温环境。茶树是多酚、色素含量特别高的植物，在叶片研磨时，茶多酚又极易氧化，形成大量的氧化产物，这些物质严重干扰着电泳过程。本实验对茶树叶片采用丙酮干粉制备法，改良丙酮沉降法和三氯乙酸-丙酮制干粉法三种蛋白质提取方法，并对SDS-PAGE电泳结果进行了比较分析，发现利用改良丙酮沉降法提取蛋白，不仅提取效率高，而且杂质干扰少，得到的电泳结果，蛋白条带清晰，数量多。利用这一方法对冷驯化下不同品种茶树叶片抗寒相关蛋白进行了研究，在云抗43和舒茶早中分别发现了与抗寒相关的23kd下调蛋白和51kd上调蛋白，获得了满意的蛋白SDS-PAGE分析结果。进一步对一年生舒茶早枝条进行4℃低温处理三天后，提取叶片的蛋白质，进行双向电泳实验，并用PDQuest软件分析比较舒茶早枝条叶片在低温处理下的蛋白表达谱，得到了46个量变倍数大于1.5倍的差异斑点，其中低温处理上调表达的蛋白点有31个，减弱表达的蛋白点有15个，推测这些差异蛋白点可能与低温胁迫相关。根据资料，茶树蛋白的等电点一般集中在4-6.5，综合双向电泳图谱上蛋白点的重复性，分离度，表达量各因素，选取7个蛋白点用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（MALDI—TOFMS）进行肽质量指纹谱的分析，并通过检索数据库进行蛋白质鉴定与功能预测，获得了7个蛋白的肽质量指纹图谱，经数据库检索鉴定分析，6个为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶蛋白家族，1个为转酮醇酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物抗寒性研究进展
• 1.1.1 植物生理生化变化与抗寒性的研究现状
• 1.1.2 低温胁迫对植物分子反应机制的影响
• 1.2 茶树抗寒性研究进展
• 1.2.1 茶树形态结构与抗寒性的研究现状
• 1.2.2 茶树生理生化变化与抗寒性的研究现状
• 1.2.3 茶树抗寒分子机制的研究现状
• 1.3 植物蛋白质组学研究进展
• 1.3.1 蛋白质组的概念
• 1.3.2 蛋白质的分离
• 1.3.3 蛋白点的鉴定
• 1.3.4 图像分析
• 1.3.5 蛋白质的鉴定
• 1.3.6 蛋白质的信息处理
• 2 引言
• 2.1 研究意义及目的
• 2.2 研究内容
• 2.2.1 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.2 双向电泳
• 2.2.3 质谱分析
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料与处理
• 3.1.1 SDS-PAGE 电泳材料处理
• 3.1.2 双向电泳材料处理
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 实验中常用试剂配方
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 蛋白质的提取
• 3.3.1.1 蛋白质丙酮干粉制备法
• 3.3.1.2 改良丙酮沉降法
• 3.3.1.3 三氯乙酸-丙酮制干粉法
• 3.3.2 蛋白定量
• 3.3.3 SDS-PAGE
• 3.3.4 双向电泳
• 3.3.5 质谱分析
• 3.3.5.1 实验主要参数
• 3.3.5.2 实验步骤
• 4 结果分析与讨论
• 4.1 蛋白质丙酮制干粉法结果分析
• 4.2 改良丙酮沉降法与三氯乙酸-丙酮制干粉法结果分析
• 4.3 利用优化的方法分析冷驯化下不同品种茶树叶片抗寒相关蛋白
• 4.4 双向电泳结果分析
• 4.5 质谱结果分析
• 5 结论
• 5.1 三种蛋白质提取方法的比较优化
• 5.2 SDS-PAGE 电泳
• 5.3 双向电泳
• 5.4 质谱分析
• 参考文献
• 附录 A 中英文缩写与注释
• 附录 B 双向电泳重复胶
• 致谢
• 作者简介
• 成果清单