甘草多糖的结构分析及免疫调节作用研究

论文摘要

本文主要以传统中药甘草切片为原料,研究甘草多糖的提取工艺,甘草多糖的特性结构分析以及其对实验用小鼠免疫能力的调节作用。首先,在实验原料的选择上,通过对常见的几种甘草原料中,主要活性成分甘草酸和甘草多糖的含有量的比较,确定人工种植3～5年生甘草根小侧枝部位切片甘草酸含量为2.9%,多糖含量达5.0%,为最佳原料,用于本文的后续研究。在提取工艺研究中,通过单因素、正交实验研究,以分析纯葡萄糖为参照,以苯酚硫酸法测定多糖含量,确定最佳提取工艺为90℃水浴,30倍料/液比,0.5 h,提取两次。在甘草多糖的纯化过程中,用正交实验方法确定醇沉工艺,为80%乙醇,常温,12 h。通过比较选择使多糖组分损失较少的Sevage法,脱除甘草多糖粗提物中的蛋白质杂质。脱蛋白后的甘草多糖经冻干,所得样品为不含小分子杂质和游离蛋白杂质的甘草多糖（为指代清晰,后文称甘草原多糖）。将甘草原多糖溶于生理盐水,配制成一定浓度的口服溶液,对BalB/C小鼠进行灌胃,研究其体内免疫调节作用。主要选取碳粒廓清实验、淋巴细胞转化实验和血清溶血素实验。结果表明,甘草原多糖在适宜的剂量水平可以显著（P＜0.01）提高小鼠的非特异性免疫和特异性免疫能力。将甘草原多糖复溶于蒸馏水,可溶性多糖经DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶层析柱分级分离,得到GPS-1b、GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a。将GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a用于特性结构分析和活性研究。通过红外光谱分析,确定其具有多糖特征结构;苯酚硫酸法测定总糖含量（以分析纯葡萄糖计）分别为87.8%,86.8%和82.3%,考马斯亮兰法测定其中结合蛋白含量分别为1.88%,7.54%和9.89%;气相色谱法研究其单糖组成,三种多糖均含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖;β-消去实验发现糖链与结合蛋白存在-O-的连接方式。原子力显微镜观察GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的微观形态,发现存在明显不同,分别呈现平面网状,立体网状和大小不均一的分散的聚集体形态。在对GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的体外免疫活性研究中发现,GPS-4a在淋巴细胞转化实验中表现出高于其它两种的活化淋巴细胞的能力;而在NK-细胞杀伤实验中,GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a均对NK-细胞对靶细胞的杀伤能力有所增强,但GPS-3a的效果略低于其他两者,这与其结构和微观形态上的差异存在不可分割的关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 甘草概况
• 1.1.1 甘草资源概况
• 1.1.2 甘草的开发利用价值
• 1.1.3 甘草多糖研究现状
• 1.2 纯化分析常用方法
• 1.2.1 多糖含量的测定
• 1.2.2 离子交换层析法
• 1.2.3 凝胶层析法
• 1.2.4 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.2.5 气相色谱法
• 1.2.6 高碘酸氧化及Smith降解
• 1.2.7 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.8 红外光谱
• 1.2.9 β—消去反应
• 1.2.10 原子力显微镜
• 1.2.11 碳粒廓清实验
• 1.2.12 淋巴细胞增殖与MTT法
• 1.2.13 血清溶血素实验
• 1.2.14 NK细胞活性检测实验
• 1.3 研究目的
• 1.4 研究方案概述
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验原料的选择
• 2.2.2 甘草多糖的提取条件研究
• 2.2.3 甘草多糖的除杂
• 2.2.4 甘草原多糖的分级分离
• 2.2.5 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的结构分析
• 2.2.6 甘草原多糖的体内免疫活性
• 2.2.7 甘草原多糖体内给药实验组小鼠氧化指标的测定
• 2.2.8 甘草原多糖的体外免疫活性
• 2.2.9 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的体外免疫活性研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 不同甘草原料的品质评价
• 3.1.1 甘草酸含量测定
• 3.1.2 甘草多糖含量测定
• 3.2 甘草多糖的提取条件研究
• 3.2.1 甘草多糖的提取条件的单因素实验
• 3.2.2 甘草多糖的提取条件的正交实验
• 3.3 甘草多糖除杂
• 3.3.1 甘草多糖与小分子杂质的分离条件研究（醇沉条件）
• 3.3.2 甘草多糖粗提物中蛋白质的脱除
• 3.4 甘草原多糖分析
• 3.4.1 甘草原多糖中中性糖含量
• 3.4.2 甘草原多糖的红外光谱定性分析
• 3.5 甘草多糖的分级分离
• 3.5.1 DEAE-cellulose（OH-）色谱法对甘草多糖的分级
• 3.5.2 Sephadex G-100对GPS-1、GPS-2、GPS-3和GPS-4的分离
• 3.5.3 GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的纯度鉴定
• 3.5.4 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的结构分析
• 3.5.5 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的原子力显微镜观察
• 3.6 甘草原多糖的体内免疫活性研究
• 3.6.1 低免疫力模型验证
• 3.6.2 甘草原多糖对小鼠非特异性免疫能力的影响
• 3.6.3 甘草原多糖对小鼠细胞免疫能力的影响
• 3.6.4 甘草原多糖对小鼠体液免疫能力的影响
• 3.7 甘草原多糖的体内抗氧化活性研究
• 3.7.1 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力的测定
• 3.7.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定
• 3.7.3 丙二醛（MDA）含量的测定
• 3.8 甘草原多糖的免疫调节活性的体外实验研究
• 3.8.1 甘草原多糖对细胞免疫能力的影响
• 3.8.2 甘草原多糖对体液免疫能力的影响
• 3.8.3 甘草原多糖对非特异性免疫能力的影响
• 3.9 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的体外免疫活性研究
• 3.9.1 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a对T细胞免疫水平的影响
• 3.9.2 甘草多糖GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a对NK细胞活性的影响
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢