口蹄疫A型病毒AF/72株主要B细胞表位的筛选鉴定

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的急性、烈性、高度接触性传染病。口蹄疫病毒（FMDV）是微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）、口疮病毒属（Aphthovirus）的代表性成员,有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型等7个血清型。FMDV上的B细胞表位,是病毒抗原分子的免疫活性区,可以被B细胞受体（B cell receptor,BCR）识别激活进而刺激机体产生特异性抗体。本试验从FMD A型病毒AF/72株的BHK-21细胞培养物中提取总mRNA,根据GenBank中已经发表的其他FMD A型病毒基因序列,设计PCR扩增引物,利用RT-PCR技术扩增P1、2ABC后,将其产物与pGEM-T easy载体连接,构建重组克隆载体pGEM-T-P1、pGEM-T-2ABC并进行序列测定。基因测序结果表明,本试验所获得的P1、2ABC基因核苷酸序列和所编码氨基酸序列与GenBank中收录的其他A型FMDV蛋白P1、2ABC基因同源性较高,分别达到92%和94%以上。在对P1、2ABC蛋白进行同源建模的基础之上,运用多种抗原表位分析方法,对VP2、VP3、2C上潜在的B细胞表位进行预测,并人工合成相应的表位肽段。根据基因测序结果,分别重新设计并合成原核表达引物,并以重组质粒pGEM-T-P1、pGEM-T-2ABC为模板,进行PCR扩增,获得VP2、VP3、2C基因片段。原核表达载体pET-28a（+）和目的基因VP2、VP3、2C扩增产物分别经相应酶切后连接,构建重组原核表达载体pET-VP2和pET-VP3、pET-2C,并将其分别转化到BL21（DE3）宿主菌中,用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析表明,基因片段VP2、VP3、2C在大肠杆菌中成功获得了表达,结构蛋白VP2分子量大小为25KDa左右,结构蛋白VP3分子量大小为24KDa左右,非结构蛋白2C分子量为36KDa左右,与预期的大小吻合,并且所表达的目的蛋白大部分以包涵体形式存在。将包涵体纯化后,与弗氏佐剂乳化配制疫苗,免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,经间接ELISA和Western Blot分析表明兔抗VP2、VP3、2C多克隆抗体的效价都达到了1:16000以上,且具有较高的特异性。以人工合成的抗原表位肽段作为抗原,制备的多克隆抗体作为一抗,辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG作为二抗,参照常规间接ELISA方法对潜在表位进行筛选鉴定。结果显示,结构蛋白VP2上的1aa-12aa和165aa-183aa肽段具有较好的反应原性,结构蛋白VP3上的30aa-46aa、128aa-142aa和206aa-221aa肽段具有较好的反应原性,而非结构蛋白2C的优势B细胞表位存在于1aa-16aa和41aa-56aa。综上所述,A型FMDV主要B细胞表位的筛选鉴定为进一步研发FMD A型多表位疫苗提供了重要技术参数。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 英文缩略表
• 第一章 序言
• 第二章 文献综述
• 2.1 抗原表位的研究方法
• 2.2 FMDV 抗原表位的研究进展
• 2.3 FMD 表位疫苗的设计及优化
• 2.4 表位疫苗研究存在的问题及展望
• 2.5 本研究的目的和意义
• 第三章 FMDV AF/72 株结构蛋白 P1 及非结构蛋白 2ABC 基因的克隆和 B 细胞表位预测
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 FMDV AF/72 株结构蛋白 VP2、VP3 和非结构蛋白 2C 的原核表达及多克隆抗体的制备
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五章 FMDV AF/72 株结构蛋白 VP2、VP3 及非结构蛋白 2C 上 B细胞抗原表位的筛选
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 第六章 研究结论
• 参考文献
• 致谢
• 导师简介
• 作者简历