论文摘要
神经元限制性沉默因子（Neuronal Restrictive Silencer Factor，NRSF）作为一种转录负调控因子，参与调控神经元特异性基因的表达。最近的研究表明NRSF还参与调控胰岛细胞中神经特异性基因及胰岛相关基因的表达。本研究拟进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其它NRSF调控基因，进一步揭示NRSF在胰岛发育过程中的作用。根据已有的研究及分析，我们通过筛选和序列比对发现人胰岛素基因核心启动子区及CART基因启动子区分别有一段与NRSE相似的序列，都可能受NRSF调控。对于两种基因我们分别进行了研究。首先，我们利用电泳迁移率变动分析实验观察人胰岛素启动子中NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况；同时，我们构建了含NRSF基因的慢病毒载体并包装病毒，获得了稳定表达NRSF的INS-1细胞；构建了含人胰岛素启动子—荧光素酶（hInsP-LUC）的慢病毒载体及含2拷贝人胰岛素启动子NRSE样基序—荧光素酶（NRSE-LUC）的报告载体，结果表明，稳定转染分析中人胰岛素启动子的活性下降了38.1％，瞬时转染中启动子转录下降了51.5％，这说明NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性；瞬时转染实验也显示NRSF能明显抑制NRSE-LUC的活性，此结构介导的转录活性在NRSF表达组中的转录活性比对照组下降了32.6％。对于CART基因，电泳迁移率变动分析实验证实其NRSE片段可以和NRSF结合；在INS-1中和PC12中，转染NRSF分别使CART启动子的转录活性下降64.6％和42.3％；在INS-1中和PC12中，NRSE基序介导的转录活性也被NRSF抑制，分别比为对照组下降了45.5％和43.2％，这说明CART基因通过此NRSE被NRSF调控；在Hela中干涉NRSF后，启动子转录活性上升为2.41倍，NRSE片段介导转录活性上升为2.45倍；RT-PCR结果也表明NRSF可阻遏内源性CART基因的转录；组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的引入使转录活性大幅上升，进一步证实NRSF通过组蛋白去乙酰化作用进行了转录抑制调控。结论：人胰岛素基因启动子中含有NRSE样序列，该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性；CART基因启动子区含有的NRSE样序列也具同样的功能。
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