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两种标签引物RT-PCR结合Sanger测序检测登革病毒的研究

2020-12-07阅读(884)

两种标签引物RT-PCR结合Sanger测序检测登革病毒的研究

论文摘要

建立两种标签引物RT-PCR结合Sanger测序的方法,检测登革病毒,包括新变异的登革病毒。一种方法可以快速诊断急性期单一血清型感染的登革热,另一种方法可以诊断双重血清型感染的登革热。3’末端锚定-标签引物RT-PCR（NAT-PCR）结合Sanger测序法是利用登革病毒（“正链”）3’最末端的保守序列作为锚定靶点进行反转录,合成带有3’最末端序列的cDNA（“负链”）（RT步骤）,以登革病毒特异性的简并引物合成cDNA的第二条链（SS步骤）。由于cDNA合成引物与简并引物的5’末端均带有人工设计的“标签”序列,所以新合成的第二条链（“正链”）的两端分别带有彼此互补的“标签”序列,再以“标签”序列作为引物进行PCR扩增（AMP步骤）。扩增产物带有的相同3’最末端序列（cDNA合成引物）作为测序引物进行Sanger测序。并利用SYBR Green I real-time PCR进行监测和筛选NAT-PCR产物及其反应参数,优化出最佳的NAT-PCR扩增效率以及最快速的Sanger测序程序。该方法对A型流感病毒、拉沙病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒和黄热病病毒检测不到可读序列,具有较好的特异性;对四个血清型登革病毒RNA的检出限为11-31个拷贝/反应（两步NAT-PCR）或110-310个拷贝/反应（一步NAT-PCR）,敏感性较高。对25份临床血清样本RNA的检测结果与临床诊断一致,可获得400-520bp的可读序列,其中包括3份登革I型、5份登革II型、3份登革III型病毒阳性样本,其他样本均为阴性结果。一步NAT-PCR比两步NAT-PCR获得检测结果好:阳性检出率较高、可读序列更长。随机PCR方法也是利用标签引物进行RT-PCR,扩增的步骤与NAT-PCR方法相同,但以随机引物进行反转录和cDNA第二条链的合成。获得的扩增产物进行TA克隆,以单克隆的M13 PCR产物为模板进行Sanger测序。通过优化反应条件,并利用SYBR Green I real-time PCR和Bioanalyzer DNA质量分析仪进行监测和筛选,优化出无偏嗜扩增的随机PCR反应模式,可对双重感染以及因RNA降解而缺失3’末端序列的所有登革病毒进行检测。该方法不仅可以检测登革病毒,还可以检测样本中其他的单链不分节段RNA病毒以及该类型的未知病毒。其测序鉴定登革病毒的敏感性为100个拷贝的RNA/μl血清。检测DENV-1和DENV-2的混合感染样本,Sanger测序鉴定的阳性克隆率分别为21/92和32/96。对25份临床血清样本RNA的阳性检测结果与临床诊断一致,也与NAT-PCR结合Sanger测序的检测结果一致;但在阴性样本中,有1例被鉴定含有丙型肝炎病毒。在所有的阳性样本中,没有发现双重血清型登革病毒感染的样本。NAT-PCR结合Sanger测序方法,通过锚定3’末端高度保守的序列,以单管反应同时鉴定四个血清型的登革病毒及其新变异毒株。该方法可在5个小时内完成从样本RNA的提取到序列分析的全过程,检测特异性强、敏感性高,具有广泛的临床应用价值。由于在登革热流行非常严重的地方会出现双重感染的情况,为此本研究建立了随机PCR结合TA克隆和Sanger测序的方法可诊断双重血清型登革病毒的混合感染,并具有检测新的病毒变异株以及未知病毒的能力,有助于发现由单股正链不分节段的RNA病毒引起的人或动物传染病的混合感染。

论文目录

  • 内容提要
  • 引言
  • 第一篇 文献综述
  • 第1章 登革热概述
  • 1.1 病原学
  • 1.2 流行病学
  • 1.3 登革热的流行
  • 1.4 致病机理
  • 1.5 鉴别诊断
  • 1.6 登革热的早期预防与控制
  • 1.7 登革热的治疗
  • 第2章 登革病毒的主要检测技术及研究进展
  • 2.1 病毒的分离鉴定
  • 2.2 免疫学检测
  • 2.3 分子生物学检测
  • 2.4 测序技术
  • 第二篇 研究内容
  • 第1章 SYBR Green I Real-time PCR 定量分析方法的建立
  • 1.1 材料与方法
  • 1.2 结果
  • 1.3 讨论
  • 1.4 小结
  • 第2章 锚定-标签引物RT-PCR结合Sanger测序快速检测登革病毒方法的建立与初步应用
  • 2.1 材料与方法
  • 2.2 结果
  • 2.3 讨论
  • 2.4 小结
  • 第3章 血清中病毒RNA 纯化方法的建立
  • 3.1 材料与方法
  • 3.2 结果
  • 3.3 讨论
  • 3.4 小结
  • 第4章 随机PCR结合Sanger测序检测双重血清型感染的登革病毒
  • 4.1 材料与方法
  • 4.2 结果
  • 4.3 讨论
  • 4.4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果
  • 致谢
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 导师简介
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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