GFP泄漏试验检测化妆品眼刺激性的初步研究

论文摘要

目的：活体兔眼刺激（Draize）试验是评价化妆品安全性的主要方法。但是,在全球化的动物保护组织的影响下,现在很多发达国家普遍开展了以替代、减少和优化为核心的“3R”运动,旨在保护动物尽可能少的进行活体实验。因而,国内外科学家在发展科学可靠的眼刺激试验离体替代方法方面进行了大量探索,包括离体器官模型、绒毛膜尿囊膜试验和离体细胞试验等。目前,尚没有任何一种方法有充分的试验依据证明能够完全替代动物眼刺激性试验。本研究则通过转基因方法,使动物细胞内表达绿色荧光蛋白,在一定条件下,加入22种受试物后,分析22种受试物对细胞中GFP泄漏率、变性率以及增殖抑制率的相关性,进而反映受试物对细胞膜完整性破坏情况,结合受试物MAAS值,建立体外眼刺激替代试验的新方法。方法：1、受试物对细胞中GFP泄漏率与变性率的研究：将SIRC细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,培养条件为37℃,5% CO2；一般2-3天传代一次；待细胞的汇合度达到80%时,用T=107TCID50/mL滴度的Pshuttle-CMV-GFP病毒液感染；病毒感染24h后,通过荧光倒置显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率（细胞发光数）达到80%以上时,收集发光细胞,制备成5×105/mL细胞悬液备用；另取部分制备好的细胞悬液经反复冻融,制成细胞裂解液；将18种受试样品用含1%牛血清白蛋白的0.1mol/L的PBS配成浓度为10%、1%和0.1%的溶液,向容积为500μL的EP管中加入200μL细胞悬液或细胞裂解液和200μL样品；对照组以含1%牛血清白蛋白的0.1mol/L的PBS替代样品；每处理组重复样本数为3；在37℃摇床中孵育10min,以2000r/min离心10min,取上清液200μL加入96孔酶标板；在酶标仪上以485nm和535nm测样品处理组上清液发光度值、对照组上清液发光度值以及对照组发光度值,计算得出GFP漏出率；在酶标仪上以485nm和535nm测对照组裂解液发光度值、乳酸组裂解液发光度值,计算细胞GFP的泄漏率、变性率,分析细胞GFP泄漏率与受试物MMAS值的相关性,以便进行下一步试验对照。2、受试物对细胞生长增殖的影响：将处于生长对数期的SIRC细胞接种于96孔板,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h,待其贴壁的汇合度约为20%-50%后,经不同处理组：受试物处理组（受试物浓度分别为10%、1%和0.1%的溶液）、阴性对照组（DMSO浓度为0.1%）处理2h后,弃去培养基,用PBS清洗一次,每孔加入培养基100μL和MTT（5mg/mL）20μL。轻轻敲打培养边缘使之混匀,用锡箔纸包好置于37℃、5% CO2的二氧化碳培养箱内孵育4h。小心弃去各孔内的上清,每孔加入150μL二甲亚砜,置于酶标仪上振荡10min,使结晶物充分溶解,在波长490nm下测定各孔的光吸收值,记录结果；计算各组细胞的生长抑制率：生长抑制率（IR）=[（对照组平均OD490值-实验组平均OD490值）/对照组平均OD490值]×100%。3、GFP泄漏率实验和MTT实验同MASS值相关性分析：根据上述实验方法1、2的实验结果,将所得细胞中GFP泄漏率、变性率以及细胞增殖率用SPSS软件进行相关性分析,对比两种实验方法与MASS值之间相关性大小,用于验证本试验方法划分不同物质眼刺激性与MASS值划分的一致性。结果：1、22种受试物中,通过家兔眼刺激试验划分等级为“1”的有5种化合物,划分等级为“2”的有11种化合物,划分等级为“3”的有6种化合物。2、22种受试物处理293细胞后,通过293细胞GFP泄露试验划分等级为“1”的有9种化合物,等级划分为“2”的有8种化合物,等级划分为“3”的化合物有5种,以Draize试验结果为依据,得到293细胞GFP泄露试验的一致性为77.3%,假阳性率为0,假阴性率为23.5%。3、22种受试物处理SIRC细胞后,通过SIRC细胞GFP泄露试验划分等级为“1”的有6种化合物,等级划分为“2”的有9种化合物,等级划分为“3”的化合物有7种。以Draize试验结果为依据,得到SIRC细胞GFP泄露试验的一致性为90.9%,假阳性率为0,假阴性率为5.9%。4、22种受试物处理293细胞后,通过293细胞MTT试验划分等级为“1”的有5种化合物,等级划分为“2”的有10种化合物,等级划分为“3”的化合物有7种；以Draize试验结果为依据,得到293细胞MTT试验的一致性为68.1%,假阳性率为40%,假阴性率为11.8%。5、22种受试物处理SIRC细胞后,通过SIRC细胞MTT试验划分等级为“1”的有8种化合物,等级划分为“2”的有8种化合物,等级划分为“3”的化合物有6种。以Draize试验结果为依据,得到SIRC细胞MTT试验的一致性为59.1%,假阳性率为20%,假阴性率为23.5%。结论：本试验确定一种操作简便快速、适用的受试物谱广、预测准确性高的眼刺激替代方法。根据5%和0.5%浓度下的最后得分值将化合物分级为无、轻微刺激性,中度刺激性,重度刺激性,并将试验中分级为中度和重度的化合物归为眼刺激阳性,将分级为无、轻微的化合物归为眼刺激阴性。本试验仅以兔角膜上皮细胞（SIRC细胞）为例,所建立的方法也适用于Hela、HepG2、C2C12等细胞系。本试验仅以腺病毒表达载体为例,其中也包括能在细胞中表达绿色荧光蛋白的其他转基因方法,如：质粒、逆转录病毒、慢病毒等方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 综述
• 1.1 化妆品中不同有害物质评价体系
• 1.1.1 化妆品中禁限用金属元素等检测技术研究
• 1.1.2 化妆品和原辅料中其他禁限用药物和致敏因子检测技术研究
• 1.1.3 化妆品中危害性物质风险评估和安全性评价研究
• 1.1.4 化妆品适应性评价研究
• 1.1.5 防晒类化妆品体外模拟功效评价方法的建立
• 1.1.6 化妆品动物替代安全性评价体系
• 1.2 急性眼刺激性/腐蚀性试验——家兔眼刺激实验
• 1.3 眼刺激替代试验的研究方法及其进展
• 1.3.1 离体器官
• 1.3.2 鸡胚绒毛膜尿囊膜实验
• 1.3.3 细胞毒性试验（Cytotoxicity）
• 1.3.4 其他实验方法
• 1.3.5 眼刺激替代实验应用策略研究进展
• 1.3.6 不同体外眼刺激替代试验方法的比较
• 1.4 本研究的目的、意义及内容
• 1.5 本研究的技术原理及主要技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞与病毒液
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 受试物
• 2.1.5 培养基与溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞的培养与传代
• 2.2.1.1 细胞培养体系
• 2.2.1.2 细胞培养常用技术和方法
• 2.2.2 腺病毒制备和滴度测定
• 2.2.3 受试物对细胞中GFP泄漏率与变性率的研究
• 2.2.4 通过MTT实验测定细胞增殖抑制率
• 2.2.5 细胞泄漏率实验与刺激性试验结果等级的划分
• 2.2.6 细胞生长抑制率实验与刺激性试验结果等级的划分
• 2.2.7 阴性阳性划分
• 2.2.8 统计分析
• 3 结果
• 3.1 293细胞GFP泄漏实验评价化合物眼刺激性
• 3.2 SIRC细胞GFP泄漏实验评价化合物眼刺激性
• 3.3 293细胞MTT实验评价化合物眼刺激性
• 3.4 SIRC细胞MTT实验评价化合物眼刺激性
• 3.5 两种实验方法对22种化合物分级的比较
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 英汉缩略语表
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果
• 致谢