猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定及其对小鼠的致病性

论文摘要

猪流行性感冒（swine influenza, SI）是由正粘病毒科A、B、C型流感病毒属的猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）引起的一种急性、传染性呼吸系统疾病。A型猪流感病毒可以引起世界性大流行。猪的呼吸道上皮细胞不仅有禽流感病毒吸附所需要的α-2,3唾液酸受体,还具有人流感病毒吸附所需要的α-2,6唾液酸受体。因此猪既可以感染禽流感病毒也可以感染人流感病毒,猪就像一个“混合器”,不同来源的流感病毒在猪体内发生重排、突变的概率大大提高。因此,猪被认为是新流感病毒产生的中间宿主。人类历史上的三次流感病毒世界大流行（1918年的西班牙流感病毒H1N1大流行、亚洲流感病毒H2N2大流行、香港流感病毒H3N2大流行）后来证明都跟猪流感有关。因此对猪流感病毒的流行情况进行监测具有重要的公共卫生意义。2009年3月墨西哥新甲型流感病毒H1N1爆发,并迅速形成世界性大流行,发病人群主要是学生以及青壮年人。后来的研究证明,此次大流行的新甲型H1N1流感病毒是混合了禽源流感病毒、人源流感病毒和猪源流感病毒特征的重组病毒。对猪群中猪源H1N1流感病毒进行流行病学监测对于防止重大疫情的发生,最大程度降低经济损失,具有重要的意义。为了解江苏省猪群中甲型H1N1流感的流行病学现状及其病原学特征,2010年1月-2010年5月对江苏地区的苏北（盐城）、苏中（扬州）、苏南（无锡）三个监测点的屠宰场、养殖场及发病猪群进行样品的采集与病毒分离,累计采集猪鼻拭子1029份,并从中分离鉴定了11株H1N1亚型猪流感病毒与2株H9N2亚型猪流感病毒。我们对其中的8株H1N1亚型的猪流感病毒进行了全基因测序和遗传进化分析,发现8株猪源H1N1亚型流感病毒均为低致病性甲型流感病毒,分离于无症状猪群,属于三重重组病毒,可能源于北美新毒株A/California/04/2009。各基因与其来源毒株相比均尚未再发生基因重排,但HA蛋白中决定唾液酸（SA）受体结合类型的相关位点：225位有3个毒株由D突变为G,240位有5个毒株由Q突变为R,增强了对Saa2,3Gal受体的结合能力；NA蛋白8个潜在的糖基化位点中,也有2个毒株的第50位NQS氨基酸替换为NPS使其潜在糖基化位点缺失,这些都可能是病毒在猪群中适应的结果,推测新甲型H1N1流感病毒在猪体内经过一段时间适应后很有可能在我国猪群中成为新的优势流行株。为了对分离到的猪源甲型H1N1流感病毒的致病性有进一步的了解,随机选取一株分离毒株：A/Swine/Jiangsu/48/2010,50μl,1×107.68EID50/只,滴鼻接种ICR小鼠,并设接触组与对照组,以研究病毒的水平传播能力。接种后每天收集体重数据,并在第3、7、11、14天捕杀小鼠,观察心、肝、脾、肺、肾、气管的组织病理学变化,并进行病毒分离。结果表明：攻毒组小鼠与接触组小鼠体重早期有不同程度的下降,后期逐渐恢复。攻毒小鼠出现了以肺损伤为主要特征的病理变化,接种第3天、7天捕杀的小鼠分离出了病毒,第11天与14天捕杀的小鼠未能分离出病毒。接触组小鼠也出现类似的病理变化,只是症状轻相对较轻,但是接触组整个实验过程都没有分离到病毒,说明本次分离到的病毒可能可以在ICR小鼠间传播,但是更多证据有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述：猪源甲型流感病毒H1N1的研究进展
• 1 猪源甲型流感病毒H1N1的概况及其历史
• 2 猪流感病毒的病原学
• 2.1 猪流感病毒的形态
• 2.2 流感病毒的分类和命名
• 2.2.1 流感病毒的分类
• 2.2.2 流感病毒的命名
• 2.3 猪流感病毒的分子生物学特性
• 2.3.1 猪流感病毒的基因组结构
• 2.3.2 猪流感病毒各基因编码的蛋白的功能
• 2.3.2.1 血凝素（Hemagglutinin,HA）
• 2.3.2.2 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
• 2.3.2.3 非结构蛋白（Nonstructural Protein,NS）
• 2.3.2.4 核蛋白（Nucleoprotein,NP）
• 2.3.2.5 基质蛋白（matrix protein, MA）
• 2.3.2.6 聚合酶蛋白（Polymerse,P）
• 3 猪流感病毒抗原的遗传变异
• 3.1.1 抗原转变
• 3.1.2 抗原漂移
• 3.1.3 RNA片段重组
• 4 猪流感病毒的发病机理
• 5 猪流感病毒的临床症状与病理变化
• 5.1 猪流感病毒的临床症状
• 5.2 猪流感病毒的病理变化
• 6 猪流感的流行病学
• 7 猪流感病毒的防制
• 参考文献
• 第一章 江苏猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 禽流感阳性抗原与阳性血清
• 1.1.2 SPF鸡胚
• 1.1.3 生物试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.1.5 相关溶液的配制
• 1.1.5.1 病毒保护液的配制
• 1.1.5.2 1%的SPF鸡红细胞的制备
• 1.1.5.3 LB培养基的制备
• 1.1.5.4 AIX固体培养基的制备
• 1.2 猪鼻咽拭子
• 2 方法
• 2.1 病毒的分离及初步鉴定
• 2.1.1 血凝试验（HA）
• 2.2 病毒的鸡胚克隆纯化
• 2.3 病毒亚型的鉴定
• 2.3.1 血凝抑制实验（H1）
• 2.3.1.1 4单位抗原的稀释与校正
• 2.3.1.2 血凝抑制试验
• 2.4 病毒基因的克隆、序列测定和遗传演化分析
• 2.4.1 病毒RNA的提取
• 2.4.2 病毒RNA的反转录
• 2.4.3 PCR扩增
• 2法制备感受态细胞'>2.4.4 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.4.5 连接产物的转化
• 2.4.6 蓝白斑筛选
• 2.4.7 SDS碱裂解法小量制备质粒DNA
• 2.4.8 重组克隆质粒的酶切鉴定
• 2.4.9 病毒全基因序列的遗传进化分析
• 3 结果
• 3.1 病毒的分离及鉴定
• 3.2 H1N1亚型的猪流感病毒全基因分析
• 3.2.1 HA基因分析
• 3.2.2 NA基因分析
• 3.2.3 NP基因分析
• 3.2.4 PA基因分析
• 3.2.5 PB1基因分析
• 3.2.6 PB2基因分析
• 3.2.7 M基因分析
• 3.2.8 NS基因分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 一株猪源甲型H1N1流感病毒对ICR小鼠的致病性
• 1 实验材料
• 1.1 生物材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 饲料
• 1.1.3 实验毒株
• 1.1.4 麻醉剂与苏醒剂
• 1.1.5 实验场所
• 1.2 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 试验用病毒的大量制备
• 2.2 实验动物的分组
• 2.3 血凝试验（HA）
• 2.4 麻醉、攻毒
• 2.5 病理切片的制作
• 2.6 病毒的分离
• 2.8 数据采集
• 3 结果与分析
• 3.1 实验小鼠的死亡情况及攻毒后的临床症状
• 3.2 解剖病理变化
• 3.3 显微组织病理变化
• 3.3.1 肺组织的病理变化
• 3.3.2 脾脏的病理变化
• 3.3.3 肝脏的病理变化
• 3.3.4 肾脏的病理变化
• 3.3.5 心脏的病理变化
• 3.3.6 气管的病理变化
• 3.4 病毒分离结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢