减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的斯氏艾美耳球虫DNA疫苗研究

论文摘要

兔球虫病是由艾美耳科的球虫引起的一种寄生性原虫病,随着规模养兔的迅速发展,该病对我国养兔业的危害日益严重。目前,报道的感染家兔的艾美耳属球虫有15个种,其中斯氏艾美耳球虫（Eimeria stiedai,Es）的致病力最强、危害最大,它寄生于兔的肝胆管上皮细胞,能引起严重的肝球虫病。尽管化学药物是目前控制兔球虫病的常用手段,但随着耐药虫株的不断出现和化学药物残留问题的日益凸现,越来越多的学者寻求用免疫学方法来防控该病。本研究应用无球虫兔和单卵囊分离技术进行了Es LZ株的分离,运用RT-PCR技术成功扩增出Es LZ株微线蛋白5（MIC-5）基因,并进行了原核表达和纯化;克隆了兔IL-15基因;以含有双启动子的pBudCE4.1为载体,构建了真核表达质粒pBMIC-5-IL-15,通过脂质体转染BHK-21细胞,证实该真核表达质粒能正确表达重组蛋白Es MIC-5和IL-15。在上述研究的基础上,根据载体-宿主平衡致死系统的原理,将asd基因引入真核表达质粒pBMIC-5-IL-15中,相继电转化asd基因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730和X4550,从而构建了pBMIC-5-IL-15-asd载体-沙门氏菌平衡致死系统。遗传稳定性试验表明,该载体能稳定存在于减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550中。用携带重组质粒pBMIC-5-IL-15-asd的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550在无球虫兔上进行了免疫试验。结果表明,重组菌X4550/pBMIC-5-IL-15-asd能诱导机体产生较高水平的抗球虫细胞免疫应答和体液免疫应答,有较好的免疫保护作用。以上试验为兔肝球虫病口服疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 内容摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 兔球虫病研究进展
• 第二章 白细胞介素15 的结构、功能及免疫佐剂活性
• 第三章 减毒沙门氏菌作为疫苗活载体的研究进展
• 第二篇 研究内容
• 第一章 斯氏艾美尔球虫单卵囊的分离及孢子生殖过程
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 单卵囊技术分离E. stiedai 球虫纯株
• 2.2 E. stiedai 孢子生殖过程
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 斯氏艾美耳球虫LZ 株MIC-5 基因的克隆、序列分析及其表达研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 Es MIC-5 基因RT-PCR 扩增
• 2.3 重组质粒pTMIC-5 的鉴定
• 2.4 Es MIC-5 基因cDNA 序列测定及推导的氨基酸序列
• 2.5 原核表达载体pETMIC-5 的鉴定
• 2.6 Es MIC-5 基因在 E. coli 中的表达及检测
• 2.7 重组蛋白MIC-5 的纯化
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 兔白介素-15 基因的克隆及其序列分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 兔IL-15 基因RT-PCR 扩增
• 2.2 重组质粒pTIL-15 的鉴定
• 2.3 兔IL-15 基因cDNA 序列测定结果及其推导的氨基酸序列
• 2.4 兔IL-15 成熟蛋白氨基酸序列二级结构与三级结构预测
• 2.5 不同物种IL-15 基因的遗传进化分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 重组表达载体pBud-MIC5-IL-15 的构建及其在真核细胞中的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 重组表达载体pB-MIC-5 的鉴定
• 2.2 重组表达载体pBMIC-5-IL-15 的鉴定
• 2.3 重组表达载体pBMIC-5-IL-15 在BHK-21 细胞中的表达
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 重组表达载体 pBud-MIC5-IL-15-asd 的构建 及转化减毒沙门氏菌
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 重组表达载体pBMIC-5-IL-15-asd 的鉴定
• 2.2 pBMIC-5-IL-15-asd转化减毒沙门氏菌的鉴定
• 2.3 重组菌X4550 /pBMIC-5-IL-15-asd 的安全性
• 2.4 重组菌X4550/pBMIC-5-IL-15-asd 的遗传稳定性
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的DNA 疫苗免疫效果研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 各试验组抗 E. stiedai ELISA 抗体检测
• 2.2 各试验组细胞免疫水平检测
• 2.3 攻虫试验
• 2.4 肝脏病理剖解变化
• 2.5 肝脏病理组织学变化
• 3 讨论
• 4 小结
• 第七章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简历及博士期间发表的学术论文
• 导师简介