论文摘要
本研究利用基因重组技术构建了hKD/APP真核表达载体,电转化毕赤酵母X-33后,筛选出稳定高效分泌表达的rhKD/APP工程菌株。经SDS-PAGE、离子交换层析、疏水层析、对胰蛋白酶的抑制特性和质谱测定,证明rhKD/APP与天然hKD/APP具有相同的序列和理化性质。利用80 L发酵罐优化发酵条件,采用甲醇诱导批式发酵,大量制备和纯化rhKD/APP用于生物活性的研究。用Seglen法分离大鼠原代肝细胞,分别在含2 %新生牛血清、rhKD/APP、BPTI及8 %新生牛血清条件培养基下观察rhKD/APP对大鼠原代肝细胞的影响。结果表明,添加rhKD/APP组的原代培养大鼠肝细胞在培养的第96 h存活的细胞数量显著高于2%新生牛血清组,在形态上仍具有典型的肝细胞样结构。发现了rhKD/APP具有延长原代培养大鼠肝细胞存活时间的生物学效应,其有效剂量和最高有效剂量分别为2.5μg·ml-1、10μg·ml-1。rhKD/APP在药效学研究方面,我们建立了小鼠急性CCl4肝损伤模型和大鼠慢性CCl4肝损伤模型,观察rhKD/APP对CCl4肝损伤小鼠血清酶及对肝脏组织病理变化的影响。结果表明,rhKD/APP各剂量组小鼠血清ALT、AST均降低,肝脏组织病理损伤得到明显改善,且呈明显的量效关系。同时观察到rhKD/APP可显著降低慢性肝损伤大鼠血清中ALT、AST及肝组织Hyp的含量,抑制ALB和A/G比值的降低,减轻肝组织纤维化程度。说明rhKD/APP对CCL4所致小鼠急性肝损伤及大鼠慢性肝损伤和肝纤维化具有保护作用。本实验的创新之处在于:1)建立了rhKD/APP大规模发酵和纯化的新工艺;2)发现了rhKD/APP能够延长原代培养大鼠肝细胞的存活时间;3)发现了rhKD/APP对实验性CCL4所致急慢性肝损伤具有保护作用。
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