论文摘要
目的从破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL的角度，探讨滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的作用机理及其所存在的差异，进而为揭示中医“肾主骨”的机理提供进一步的实验依据。方法选用雌性Wistar大鼠66只，随机分为3组：正常对照组10只、假手术组10只、造模型组46只。造模型组大鼠以45mg／kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在其麻醉状态下摘除双侧卵巢，而假手术组只摘除卵巢附近的脂肪组织，但不摘除卵巢。在术后2周，再将造模型组大鼠随机分为4组：模型组11只、己烯雌酚组11只、滋补肾阴组12只、温补肾阳组12只。然后，开始给大鼠灌胃给药。己烯雌酚组灌胃给予己烯雌酚0.045mg／kg，给药浓度为0.0045mg／ml；滋补肾阴组灌胃给予左归丸9.52g生药／kg，给药浓度为0.952g生药／ml；温补肾阳组灌胃给予右归丸11.96g生药／kg，给药浓度为11.196g生药／ml。以上给药体积均为1ml／100g。每天一次，连续6天，休息1天后，再连续给药6天，每周称重一次，据此调整给药量。如此给药3个月。正常对照组、假手术组和模型组按同法灌服等体积的蒸馏水。各组大鼠于处死前16天和前3天分别腹腔注射盐酸四环素30mg／kg体重，以对骨进行荧光标记。给药结束后，将各组大鼠迅速处死。取右侧胫骨制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学指标的测定；取左侧胫骨制作脱钙骨石蜡切片，用于免疫组织化学和核酸原位杂交染色，以观察胫骨的OPG和RANKL的蛋白及mRNA的表达。统计学处理方法：实验结果皆以均数±标准差((?)±s)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理，组间两两比较，采用q检验。结果1骨组织形态计量学检测结果1．1滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨TBV％的影响模型组大鼠胫骨TBV％显著低于假手术组。滋补肾阴组、温补肾阳组、己烯雌酚组的TBV％均显著高于模型组，但滋补肾阴组和温补肾阳组明显低于假手术组，而己烯雌酚组无显著性变化。与己烯雌酚组比较，滋补肾阴组和温补肾阳组TBV％均明显降低。与滋补肾阴组比较，温补肾阳组的TBV％明显增高。见表1。表1各组大鼠胫骨TBV％的变化注：与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与己烯雌酚组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与滋补肾阴组比较：☆P＜0．05；下同。1．2滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨TRS％的影响与假手术组比较，模型组大鼠胫骨TRS％显著增高。滋补肾阴组和温补肾阳组的TRS％均显著高于假手术组，但明显低于模型组。己烯雌酚组的TRS％显著低于模型组，而与假手术组相比，无显著性差异。与己烯雌酚组比较，滋补肾阴组和温补肾阳组的TRS％明显增高。与滋补肾阴组比较，温补肾阳组的TRS％明显降低。见表2。表2各组大鼠胫骨TRS％的变化1．3滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨TFS％、AFS％和MAR的影响模型组大鼠胫骨TFS％、AFS％和MAR较假手术组皆显著增高。与模型组相比，温补肾阳组的TFS％、AFS％和MAR皆明显降低，滋补肾阴组的TFS％和MAR则明显降低，但AFS％无显著性变化；与假手术组相比，滋补肾阴组和温补肾阳组的TFS％、AFS％和MAR均显著增高。与模型组相比，己烯雌酚组的TFS％、AFS％和MAR皆显著降低，而与假手术组相比，TFS％和MAR无显著性差异。与己烯雌酚组相比，滋补肾阴组和温补肾阳组的AFS％和MAR皆明显增高。与滋补肾阴组比较，温补肾阳组的TFS％和MAR皆明显降低。见表3。表3各组大鼠胫骨TFS％、AFS％和MAR的变化1．4滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨mAR和OSW的影响模型组大鼠胫骨mAR和OSW显著高于假手术组。温补肾阳组和己烯雌酚组的mAR和OSW均明显低于模型组。滋补肾阴组和温补肾阳组的mAR均明显高于己烯雌酚组。与滋补肾阴组比较，温补肾阳组的mAR和OSW无显著性差异。见表4。表4各组大鼠胫骨mAR和OSW的变化2滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨OB及MSC的OPG、RANKL蛋白和mRNA表达的影响2．1滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨OB及MSC的OPG蛋白和mRNA表达的影响模型组大鼠胫骨OB、MSC的OPG蛋白和mRNA表达阳性密度较假手术组皆显著降低。滋补肾阴组和温补肾阳组的OB、MSC的OPG蛋白和mRNA表达阳性密度显著高于模型组；己烯雌酚组的OPG蛋白和mRNA表达的阳性密度与模型组相比显著增高。见表5、6。表5各组大鼠胫骨OB OPG蛋白和mRNA表达阳性密度的变化表6各组大鼠胫骨MSC OPG蛋白和mRNA表达阳性密度的变化2．2滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢大鼠胫骨OB、MSC的RANKL蛋白和mRNA表达的影响模型组大鼠胫骨OB、MSC的RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度较假手术组皆显著增高。温补肾阳组的阳性密度明显低于模型组；滋补肾阴组与模型组无显著性差异。己烯雌酚组的RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度显著低于模型组，而与假手术组无显著性差异。见表7、8。表7各组大鼠胫骨OB RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度的变化表8各组大鼠胫骨MSC RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度的变化假手术组与正常对照组比较，以上指标均无显著性差异，从而排除手术因素对实验的影响。结论1．滋补肾阴法和温补肾阳法对去卵巢所致大鼠骨质疏松症均具有治疗作用，但温补肾阳法的效果要明显优于滋补肾阴法。2．温补肾阳法对骨质疏松症的治疗作用是通过提高OB和MSC的OPG表达以及抑制其RANKL表达实现的；而滋补肾阴法的作用途径是：提高OB和MSC的OPG表达，使之与RANKL结合增多，进而抑制OC的分化、成熟及活性。温补肾阳法的治疗效果之所以优于滋补肾阴法，其机理之一是前者对OPG和RANKL均具有调节作用，而后者只对OPG产生调节作用。