论文摘要
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）是一种小包膜RNA病毒,主要经血液传播,可引起急、慢性病毒性肝炎,并常导致慢性进行性肝病,肝硬化（Hepatocellular cirrhosis,HC）,甚至肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）。目前全球约有1.23-1.7亿人感染HCV,中国有近4千万HCV感染者,是HCV流行较严重的国家之一。因此控制HCV的传播已成为一个相当严峻的公共卫生问题。目前血清的筛查多以检测HCV抗体为主,但HCV抗体检测一般存在7-10周的窗口期,仍威胁着用血安全。虽检测HCV核酸可有效缩短窗口期,但因其操作复杂,容易污染且价格昂贵,使之不能广泛应用。HCV core蛋白在HCV感染后体内抗体阳转前即可产生,是患者体内HCV复制和HCV病毒载量的重要指标。通过检测患者体内core蛋白可有效缩短HCV检测窗口期,并可作为临床HCV抗病毒治疗效果评估的依据。因此本研究旨在初步建立HCV core抗原检测系统,并为最终成功建立HCV Ag/Ab诊断试剂奠定基础。本研究首先构建了非融合表达core区1-120aa的表达载体pTO-T7-C120,经转化E.coli表达,表达产物约为13kD（命名为c120）。c120主要表达在上清中,经饱和硫酸铵沉淀及阳离子交换柱层析纯化后,SDS-PAGE分析目的蛋白纯度可达95%以上。考虑到缺失C端的重组core抗原可能导致的构象差异及表位缺失,本研究另外构建了融合表达core区1-173aa的表达载体pTrc-CKS-C173,并经转化E.coli表达,表达产物约为45kD（命名为cks-c173）。cks-c173主要表达在包涵体中,目的蛋白可溶于8M尿素,后经电洗脱纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白纯度可达97%以上。重组蛋白c120和cks-c173经Western Blotting和间接ELISA验证表明均有良好的活性和特异性,适宜制备单抗。然后将重组蛋白c120和cks-c173及赠送重组core抗原core-R分别免疫BALB/c小鼠,并利用常规单抗制备技术和间接ELISA法筛选单抗,最终成功获得了103株抗HCV core抗原的单克隆抗体。单抗的滴度和亚型通过间接ELISA法分析。所有单抗经条带免疫印记实验证实均有良好的的活性。并利用HCV core区合成肽和间接ELISA鉴定出60株单抗的表位,共识别5个表位区。其中识别25-39aa和90-119aa的单抗最多,分别有25株和21株;识别49-78aa和17-31aa的单抗各有9株和4株;另有1株单抗识别33-47aa。此结果同时反应了重组core抗原的优势表位区,并发现3种core区重组蛋白暴露的优势表位存在差别。此外利用HCV core区合成肽和间接ELISA分析HCV患者血清中抗HCV core不同区段抗体的丰度,发现HCV患者血清中core抗体的表位谱更宽,且可能更偏构象依赖,其中49-78aa可能是天然core抗原一个重要的线性表位区。最后,将103株单抗通过正交双抗体夹心ELISA检测不同稀释度的c120蛋白以筛选出检测c120灵敏度最高的配伍单抗。结果成功筛选到6组检测c120灵敏度达100pg/mL的配伍单抗,其中配伍83-65HRP的检测灵敏度最高,可达50pg/mL。再利用这6组配伍单抗夹心检测25份HCV抗体和PCR阳性血清中的core抗原,最终发现2组能高灵敏度检测天然core抗原的配伍83-65HRP和97-65HRP,检出率达8/25,并具有较好的特异性,初步建立了HCV core抗原的检测系统。但因缺乏HCV窗口期血清,此系统还需进一步评价和改进。