论文摘要
小反刍兽疫（Peste des petitus ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petitusruminants virus，PPRS）引起山羊、绵羊等小反刍兽的一种急性、热性、接触性传染病，被国际兽医局（Office International Des Epizooties，OIE）规定为法定报告动物传染病，我国农业部制定的《法定动物疫病病种名录》中也将该病列为Ⅰ类动物疫病。目前PPRV的防控主要依靠弱毒疫苗进行免疫，但弱毒疫苗可能出现毒力返强，存在散毒的风险，且热稳定性差。病毒样颗粒（VLPs）的概念是20世纪80年代发展出现的。VLPs是一种空心颗粒或包膜状颗粒结构，含有某种病毒的一种或多种结构蛋白，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒颗粒相似，能够通过和病毒感染一样的途径，以接近真实构象的形式呈递给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应，这些优点使得VLPs一出现就受到了广大专家学者的关注。目前PPRV VLPs的研究尚属空白。本研究克隆了PPRV的四种结构蛋白N、M、F和H基因，构建了真核表达载体，进行了VLPs装配试验，并对VLPs装配和释放过程中的一些关键因素进行了探究，获得以下结果：1.构建了F蛋白的原核表达载体pET30a/F，并利用表达蛋白免疫试验兔制备了抗F蛋白多克隆抗体，经检测其效价为1:1.1×105，达到后续试验要求；2.构建了PPRV四个结构蛋白的真核表达载体pCAGGS/N、pCAGGS/M、pCAGGS/F和pCAGGS/H，分别转染Vero细胞，经间接免疫荧光、WB检测，证实构建的重组质粒均能在Vero细胞中高效表达；3.将构建的四个重组质粒共转染Vero细胞，首次成功装配释放了PPRV VLPs。并通过分别转染单个质粒和各种可能的组合确定了VLPs装配和释放的条件，认为仅有M蛋白存在即能装配并释放VLPs；4.将M蛋白全序列分为11段，进行缺失突变，构建了11个突变体，分别转染Vero细胞，通过电镜观察首次确定M蛋白序列中决定VLPs形成和释放的关键区域；5.将F蛋白跨膜区（TM）分为10段，进行丙氨酸扫描突变，构建了10个突变体，分别与其他三个蛋白重组质粒共转染Vero细胞，通过电镜观察结果，认为F蛋白TM对PPRV VLPs的装配和释放无明显影响，但会对细胞的状态产生影响。PPRV VLPs的装配成功为PPRV疫苗的研究提供了新的途径，并且为M蛋白功能的研究打开了新的思路。