鼠疫耶尔森氏菌候选疫苗靶标的筛选与初步验证

论文摘要

背景鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）（简称鼠疫菌）引起的一种甲类传染病,多重耐药菌株的产生以及鼠疫菌可以用做生物武器的可能给鼠疫的预防、治疗带来了困难。有效的疫苗接种能阻断鼠疫的传播,达到最终消灭鼠疫的目的。但是,迄今为止,还没有一种能够在大范围内使用并且切实有效的鼠疫疫苗。灭活及减毒活疫苗在20世纪亚洲鼠疫流行地区中的应用十分广泛,免疫原性与反应性的变异及短期的保护力意味着通过在整个疫区接种这类疫苗来防御鼠疫并不可行。鼠疫亚单位疫苗和DNA疫苗的研究主要集中在鼠疫菌已知的两个主要保护性抗原F1（荚膜抗原）和LcrV（V抗原）上。基于F1和LcrV抗原基础上的疫苗对腺型鼠疫具有理想的保护效果,但这类疫苗对肺型鼠疫的保护效果不甚理想。另外,鼠疫自然疫源地中存在的F1-菌株也能引起人类感染,而V抗原存在血清学变异。因此寻找其它的具有免疫保护作用的蛋白并将其与F1和LcrV抗原联合免疫或制备多亚单位疫苗是鼠疫疫苗研究的一个方向。除体液免疫外,细胞免疫是鼠疫免疫的一个重要组成部分,同时能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫的疫苗将能更有效地预防鼠疫。目前,关于鼠疫菌感染后细胞免疫的研究还很少,最近的研究发现,鼠疫菌在感染过程中产生的T细胞免疫不只是针对F1和LcrV抗原,还有其它蛋白在对鼠疫菌细胞免疫保护过程中起着作用。本课题的研究目的就是通过蛋白芯片和Elispot技术对鼠疫菌感染后机体体液免疫和细胞免疫反应进行检测从而寻找在鼠疫菌感染过程中能够刺激体液和/或细胞免疫反应的蛋白,并对部分筛选出来的蛋白进行免疫保护性的初步评价。方法通过PSORTb、SignalP和ProtcompB等生物信息学软件对鼠疫菌CO92株基因组所有编码蛋白的细胞定位进行预测,并利用TopPred软件分析蛋白的跨膜结构域,挑选出所有跨膜区少于4个的鼠疫菌的膜相关性蛋白或分泌性蛋白。结合现阶段对鼠疫菌毒力、进化、疫苗以及对其它微生物的疫苗等相关研究,挑选出所有鼠疫菌已知的、推测的毒力相关基因以及与在其它微生物的具有免疫保护性蛋白具有同源性的相关基因。利用Gateway重组克隆技术或限制性内切酶酶切克隆技术将要表达的基因克隆至表达载体pDEST17或pET32a上并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,在大肠杆菌中表达的目的蛋白通过Ni-NTA层析柱纯化。利用Elispot试验检测重组表达蛋白体外刺激鼠疫菌EV76减毒活疫苗株免疫小鼠的脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数,从而寻找能够刺激明显T淋巴细胞反应的鼠疫菌蛋白。同时利用所有体外重组表达的鼠疫菌蛋白所构建的蛋白芯片,检测感染鼠疫菌的猫、狗、人血清中抗鼠疫菌蛋白的抗体种类和反应强度,并通过对不同温度（26°C和37°C）培养条件下的鼠疫菌吸收后的患者血清抗体谱的分析寻找鼠疫菌可能的毒力相关或膜相关性蛋白。将部分挑选出的具有体液免疫和/或细胞免疫功能的蛋白免疫小鼠进行蛋白免疫保护功能的检测,被初步证明具有免疫保护功能的蛋白将作为候选疫苗靶标进行进一步的研究。结果通过生物信息学分析并结合目前对鼠疫菌的研究,共挑选出261个鼠疫菌基因作为筛选鼠疫菌疫苗亚单位的靶标。利用Array Designer软件设计相应的引物,片段<800bp的基因尽量表达全长,大于800bp的基因通过DNAStar软件分析后表达预测抗原性较好的片段。通过Gateway重组克隆技术或限制性内切酶酶切克隆技术将要表达的基因克隆至表达载体pDEST17或pET32a上,根据重组大肠杆菌克隆的SDS-PAGE电泳结果,有174个重组克隆能够在大肠杆菌中表达相应的鼠疫菌蛋白。由于所挑选基因编码蛋白大多数为膜相关性蛋白,通过Ni-NTA纯化和PBS透析后最终只有101个鼠疫菌重组蛋白的浓度与纯度满足进行细胞免疫功能检测的要求。利用Elispot试验检测EV76疫苗株免疫小鼠后小鼠针对鼠疫菌的细胞免疫反应情况,34个鼠疫菌蛋白体外能够明显的刺激EV76免疫小鼠的脾细胞分泌IFN-γ,这些蛋白被认为能够刺激T细胞免疫反应。另一方面,构建了包括218个鼠疫菌蛋白的蛋白芯片,通过对蛋白芯片与鼠疫菌感染的猫、狗和患者血清反应的抗体谱的分析,发现了20个可能在鼠疫菌侵入机体后为适应机体环境或者其它压力条件而特异性合成的蛋白,这些蛋白可能与细菌在人体内的毒力相关。结合体液免疫和细胞免疫的结果,初步对28个蛋白的免疫保护性进行检测,结果有9个蛋白能够对20LD50鼠疫菌201株的攻击产生部分保护力。结论通过对鼠疫菌感染后机体体液免疫与细胞免疫反应情况的分析,对28个能刺激体液和/或细胞免疫反应的蛋白的免疫保护性进行了检测,初步证明了9个蛋白能够对低剂量鼠疫菌201株的攻击提供部分保护力。通过本课题的研究建立了鼠疫菌反向疫苗学研究的技术路线,缩短了鼠疫菌疫苗研究的时间,为后续鼠疫菌疫苗研究提供了靶标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1、鼠疫对人类的危害与流行趋势
• 2、鼠疫免疫机制的研究
• 3、鼠疫疫苗研究的进展
• 4、反向疫苗学的研究进展
• 5、本研究的目的与意义
• 本研究的技术路线
• 参考文献
• 一 鼠疫菌候选抗原的分析与挑选
• 引言
• 一鼠疫菌候选抗原的挑选原则
• 二鼠疫菌候选抗原挑选结果
• 参考文献
• 二 候选基因的体外克隆表达
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 三 大肠杆菌重组表达蛋白的纯化
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 四 小鼠感染鼠疫菌后细胞免疫反应的检测
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 五 蛋白芯片的构建与体液免疫反应的检测
• 引言
• 1 蛋白芯片的构建
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 鼠疫菌感染猫、狗血清抗体谱
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 3 利用蛋白芯片寻找鼠疫菌毒力相关或膜相关性蛋白
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 六 蛋白在小鼠体内免疫保护性的初步检测
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 附表
• 综述
• 总结
• 个人简历
• 在读期间发表的论文
• 致谢