论文摘要
肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌上calponin和TGFβ1的变化前言肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）是慢性阻塞性肺疾患（chronicobstructive pulmonary disease，COPD）发展成肺原性心脏病（肺心病）过程中的关键环节。PAH的发病机制相当复杂。调宁蛋白（calponin）为一种平滑肌特有的调控蛋白，它的功能包括抑制平滑肌收缩，影响细胞的分裂和分化，参与细胞信号转导和维持细胞骨架等。转化生长因子β1（transtorming growth factorβ1，TGFβ1）是一种多功能的细胞活性调节因子，具有广泛的活性，如调节多种细胞的分化和细胞外基质的产生。而有关calponin和TGFβ1在野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的PAH时肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cell，PAMC）上表达的变化尚无报道。因此，我们以此为研究靶点，为临床提供治疗PAH的中药新药提供实验依据。材料与方法1、实验动物及分组雄性Wistar大鼠36只，随机选取其中12只作为正常对照组，腹腔一次性注入生理盐水溶液；其余的24只腹腔一次性注入MCT生理盐水溶液(60 mg·kg-1)。2、材料MCT购自Sigma公司；兔抗大鼠calponin多克隆抗体（一抗）购自北京博奥森生物技术公司；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体（一抗）和羊抗兔IgG（二抗）购自北京中杉生物技术公司。3、标本的取材及处理饲养21d后，处死大鼠，取出完整心肺组织，置于生理盐水中，剥离肺动脉。称取右心室（R）、左心室（L）及室间隔（S）重量。4、免疫组化SP法检测calponin和TGFβ1将4％多聚甲醛中固定的肺动脉标本脱水、透明、常规石蜡包埋、5μm连续切片。加入一抗、二抗、DAB显色。显色结果用彩色图像分析系统进行定量分析。放大倍数×400，随机选取5个视野，求出平均灰度。5、Westem印迹检测calponin和TGFβ1用RIPA buffer等裂解液抽提蛋白，酚试剂法蛋白定量，10％SDS-PAGE变性电泳，转印，封闭后加相应一抗、二抗，染色，显影，测定免疫印迹区带的光密度。6、统计分析所得数据以（?）±s表示，统计学处理采用两组间对照t检验，P＜0.05具有统计学意义。结果1、R／L+S对照组为0.26±0.03，PAH组为0.42±0.06（P＜0.05，n=12）。2、Calponin和TGFβ1蛋白表达的免疫组化检测结果对照组的calponin表达主要见于平滑肌细胞胞浆，PAH组其表达明显下降，平均灰度值由对照组129.5±22.6下降到55.2±17.1（P＜0.05，n=6）。对照组的TGFβ1微量表达，PAH组其表达明显升高，平均灰度值由对照组28.8±12.5升高到69.7±19.4（P＜0.05，n=6），阳性染色主要见于平滑肌细胞胞浆和血管外膜。3、Calponin和TGFβ1蛋白表达的Western印迹检测结果对照组和PAH组均在同一位置出现单一条带，PAH组的calponin含量明显下降，与β-actin的光密度值比较由对照组1.50±0.10下降到0.42±0.16（P＜0.05，n=6）。PAH组的TGFβ1含量明显升高，与β-actin的光密度值比较由对照组0.42±0.03升高到1.30±0.15（P＜0.05，n=6）。讨论Calponin做为一种平滑肌特有的调控蛋白，Winder等首先在离体收缩系统内发现calponin能抑制ATP酶，他们用肌球蛋白轻链激酶（myosin light chainkinase，MLCK）使肌球蛋白磷酸化，然后再加入肌动蛋白，ATP酶活性明显上升，如在反应系统内事先加入calponin，则该酶活性明显受到抑制。此结果提示，calponin与肌动蛋白结合后，阻碍肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用，从而抑制ATP酶活性。但当平滑肌接受外界刺激而收缩时，必然存在着解除这种抑制的机制。如在以往实验中，对于脑血管痉挛和高血压等血管增殖性疾病的动物模型中，可以观察到calponin表达含量的下降。TGFβ1在胚胎发生、脂肪形成、纤维发生、肌形成、软骨形成、骨发生、上皮细胞分化以及免疫细胞的功能调节方面发挥重要作用。TGFβ1的失调可能在多种疾病的形成中发挥重要作用，这些疾病包括伤口愈合过程的瘢痕形成、癌症发生、动脉硬化症、骨质疏松症、神经退行性疾病等。以往有学者分别探讨过calponin及TGFβ1在缺氧性肺动脉高压时的表达变化，本实验应用MCT复制PAH，观察到PAH组calponin蛋白含量较对照组有显著下降，PAH组TGFβ1蛋白含量较对照组有显著升高，但在PAH时，calponin与TGFβ1之间的具体关系，尚需进一步探求。结论1、Calponin、TGFβ1与PAH的形成有关。2、PAH时，calponin的表达下降。3、PAH时，TGFβ1的表达升高。
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