牛分枝杆菌MPB64蛋白的原核表达及单克隆抗体制备

论文摘要

分枝杆菌是一种革兰氏阳性抗酸杆菌，许多为环境中常在菌。大多数菌株生长缓慢，有些能够引起人和动物结核及结核样疾病，这一类分枝杆菌组成了结核分枝杆菌复合群，该菌有许多共同的抗原蛋白。MPB64蛋白是结核分枝杆菌复合群成员都合成分泌的一种早期滤液蛋白，是该复合群特异性的分泌蛋白，在菌株鉴定和疫苗研究中都有重要应用。本实验为了制备MPB64单克隆抗体，根据Genbank中已发布的Mycobacterium bovis AF2122／97菌株的mpb64基因序列设计引物，以牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株基因组DNA为模板，PCR扩增出具有完整开放阅读框架（ORF）的mpb64基因，连接到pET32a（+）中构建原核表达载体，诱导表达重组蛋白（rMPB64）。同时，将mpb64基因经BamHI和EcoRI双酶切后连接到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中，构建真核表达质粒pc-mpb64，经瞬时转染鉴定该真核质粒能够在哺乳动物细胞SP2／0中表达。以构建的真核表达质粒免疫BABL／c小鼠，采用聚乙二醇PEG介导脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞融合，用纯化的rMPB64来筛选针对MPB64蛋白的单克隆抗体，阳性的细胞株用有限稀释法进行3～4次亚克隆，最终获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为A2E5、B3G8和C5F10。对单克隆抗体亚型鉴定结果表明：A2E5为IgM亚型，轻链为λ链；B3G8和C5F10为IgG2a亚型，轻链为κ链。ELISA试验证实，3株单抗都能与纯化的rMPB64以及纯化的牛分枝杆菌培养滤液蛋白（PPD）反应，与本实验室表达并纯化的rMPB70-83-ESAT6不反应。Western blot分析表明，3株单抗都不能与经SDS-PAGE变性电泳后转移到NC膜上的rMPB64发生反应，认为制备的单克隆抗体识别的可能是MPB64蛋白的构象表位。本实验利用大肠杆菌原核表达系统成功表达和纯化了重组蛋白rMPB64，并以此蛋白为筛选抗原，采用基因免疫的方法制备了3株能够分泌针对MPB64蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，这为进一步研究MPB64蛋白的结构和功能，以及建立MPB64蛋白的检测方法奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 分枝杆菌分类及菌株全基因组测序
• 1.1.2 分枝杆菌的检测方法
• 1.1.3 分枝杆菌分泌蛋白研究进展
• 1.1.4 牛结核病概述
• 1.2 研究目的与意义
• 第二章 牛分枝杆菌特异性抗原MPB64蛋白原核表达
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 菌种、载体及宿主
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液和培养基的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 牛分枝杆菌的培养及其基因组DNA的提取
• 2.2.2 目的基因的扩增
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.4 PCR产物连接pMD18T-Vector及重组质粒的鉴定
• 2.2.5 表达载体的构建与鉴定
• 2.2.6 重组质粒pET-mpb64在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.7 融合蛋白的小量纯化
• 2.2.8 纯化蛋白的浓度测定
• 2.2.9 纯化蛋白的Western blot分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 PCR扩增目的基因
• 2.3.2 重组质粒T-mpb64的鉴定
• 2.3.3 重组质粒pET-mpb64的鉴定
• 2.3.4 目的片段的序列分析
• 2.3.5 诱导表达融合蛋白及其纯化
• 2.3.6 纯化蛋白的Western blot分析
• 2.3.7 纯化蛋白的浓度测定
• 2.4 讨论
• 第三章 MPB64蛋白单克隆抗体的制备
• 3.1 细胞、实验动物及材料
• 3.1.1 细胞、实验动物
• 3.1.2 试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 抗原的制备
• 3.2.2 真核载体瞬时表达
• 3.2.3 动物免疫
• 3.2.4 细胞融合
• 3.2.5 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
• 3.2.7 单克隆抗体的大量制备
• 3.2.8 ELISA检测
• 3.2.9 Western blotting分析
• 3.2.10 单克隆抗体的生物学鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 瞬时转染
• 3.3.2 动物免疫抗体水平检测
• 3.3.3 细胞融合
• 3.3.4 单克隆抗体亚类鉴定
• 3.3.5 Western blot鉴定
• 3.3.6 腹水与重组蛋白rMPB64反应
• 3.3.7 单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
• 3.3.8 ELISA鉴定
• 3.3.9 细胞稳定性
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录:基因扩增产物与标准序列比对
• 致谢
• 作者简介