毒死蜱降解菌的分离、mpd基因克隆与定向进化及应用研究

论文摘要

毒死蜱是一类中等毒性的有机磷杀虫剂,现已被许多国家广泛使用,由此引发的环境污染问题日益突出。环境污染的微生物修复具有其它修复方法无可比拟的优势,因此利用获得的能够高效降解毒死蜱的微生物资源,充分发挥其降解能力,进行毒死蜱残留污染环境的修复,具有非常重要的理论研究意义和实际应用价值。本研究的目标是分离、筛选能够以毒死蜱作为唯一碳源生长的降解菌株,并对该菌株在各种环境条件下降解毒死蜱的特性进行研究,以期为毒死蜱环境污染的修复工作提供科学依据；同时对其降解酶基因进行克隆和定向进化,为进一步研究其基因功能、构建具有更强降解能力的基因工程茵奠定基础。采用以毒死蜱为唯一碳源的选择性培养基,从毒死蜱污染的环境样品中分离到七株毒死蜱降解菌,分别命名为Dsp-1-Dsp-7.经生理生化鉴定和系统发育分析,七株茵属于5个不同的属。菌株Dsp-2鉴定为Sphingomonas sp.,菌株Dsp-4为Stenotrophomonas sp.,菌株Dsp-7为Brevundimonas sp.,菌株Dsp-6为Bacillus sp,其他菌株为Pseudomonas sp.。其中从Sphingomonas sp.和Brevundimonas sp.分离到毒死蜱农药降解茵尚属首次报道。对分离的毒死蜱降解菌进行基于16S rDNA序列的系统发育分析,对染色体ERIC-PCR旨纹图谱扩增及对降解特性进行比较研究,结果表明七株降解菌在遗传、生理和降解能力等方面表现出丰富的多样性。不同菌株对毒死蜱的降解能力有很大差异,其降解谱也表现出一定的差异。降解菌株Dsp-1-Dsp-4对多种有机磷类农药具有降解能力,与其他菌相比,菌株Dsp-2在液体培养基中拥有最快的降解速率,12h几乎完全降解100mg.L-1的毒死蜱,并且能降解有机磷农药丙溴磷。菌株Dsp-1在自然环境中对毒死蜱的降解效果最好。而菌株Dsp-5和Dsp-7只能降解毒死蜱农药,而不能降解其他有机磷农药。七株菌降解毒死蜱的中间产物均为3,5,6-三氯-2-吡啶酚（TCP）,且积累TCP。根据已报道的有机磷水解酶基因序列设计引物,通过PCR的方法从降解茵Dsp-1-Dsp-4中克隆到了有机磷水解酶mpd基因,mpd结构基因共有996个碱基,编码331个氨基酸序列。通过序列比较发现,在基因水平上,四株降解菌的有机磷水解酶基因可以分为3种亚型,相互之间的同源性为99%；在氨基酸水平上,四株降解茵的有机磷水解酶可以分为3种亚型,相互之间的同源性为92%。将四株降解茵的mpd结构基因分别连接到表达质粒载体pET29a上,在E. coli BL21实现了基因的高效表达。通过致突变PCR对野生型的mpd基因进行定向进化,获得了5个毒死蜱降解能力增强的突变体。其中突变子Mn7,突变了5个氨基酸位点（N271T,I275S,G277S, A280V,P304S）,水解毒死蜱的动力学参数Kcat和Kcat/Km比原始MPH分别提高10和118倍,水解3种供试的有机磷底物的相对活力都有明显的增强。通过定点突变的方法,对这些突变位点的作用进行进一步的研究。酶动力学参数的测定结果表明,单位点突变体N271I的Kcat/Km比原始MPH提高了15倍,A280V的Kcat/Km比原始MPH提高了32倍,是导致毒死蜱催化能力增强的重要位点。而F196I则使Kcat/Km下降了1倍,这可能与该位点是MPH酶作用的关键位点有关。对突变体的Mn7三维结构进行模拟分析表明,这些位点的突变并未对酶的三维结构产生明显的影响,但其二级结构分析表明a-螺旋和B-折叠的含量有所增加,这可能使得蛋白的构象更加稳定,从而提高了酶的水解活力。研究了菌株Dsp-1的最适生长条件,菌株Dsp-1的最适温度为30℃；最适生长初始pH在7左右；装液量小于150mL/250mL时,生长旺盛;Dsp-1生长不需要NaCl,无特殊生长因子要求。在供试的几种碳源中,Dsp-1对葡萄糖利用最好；在以葡萄糖为碳源时,以有机氮为氮源生长较好,在供试的几种无机氮源中,Dsp-1对NH4NO3利用最好；该菌株对多种常用抗生素敏感。在发酵培养基中,经过16h达到稳定期,菌体生长良好（>1011CFU·mL-1）,能较好的满足后续试验的要求。降解菌剂的应用试验表明,在消除土壤和蔬菜毒死蜱残留的试验中,菌株Dsp-1对毒死蜱表现了较强的降解能力。人工接种毒死蜱降解菌Dsp-1到毒死蜱污染的三种不同的土壤（红粘土、灰潮土、高沙土）,Dsp-1在3种土壤中都能有效降解毒死蜱,Dsp-1在pH中性的灰潮土中降解毒死蜱的速率最快,酸性的红粘土中降解效果较差,而碱性的高沙土中毒死蜱的自然降解作用也较明显；说明土壤pH值对降解效率的影响十分显著。相对较高的有机氮的含量也有利于毒死蜱的降解。在1-100mg-kg-1的浓度范围内Dsp-1都能有效降解土壤中的毒死蜱,对低浓度的毒死蜱降解率更高,达到90%以上。该结果显示了菌株Dsp-1具有对毒死蜱污染的土壤进行实地修复的潜力。应用Dsp-1分别对冬季和春季栽培的温室小青菜的毒死蜱残留进行降解试验,在环境条件适宜,使用推荐农药用量时,施用含1010CFU-mL-1活菌的降解菌剂可以发挥良好的作用,7天的降解效率达到80%以上,加快了毒死蜱的降解进程,从而保证在安全间隔期内达到国家的残留标准（0.1mg-kg-1）.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 第一章 有机磷农药的微生物降解研究
• 1 环境中有机磷农药的降解方式
• 1.1 光催化降解
• 1.2 化学降解
• 1.2.1 水解
• 1.2.2 氧化
• 1.3 生物降解
• 2 降解有机磷农药的微生物种类
• 3 微生物降解有机磷农药的机理
• 4 影响微生物降解有机磷农药的因子
• 4.1 理化因子
• 4.2 生物化学因子
• 4.3 底物浓度因子
• 5 有机磷降解酶基因及其研究进展
• 6 常见有机磷降解酶基因结构与功能的研究
• 6.1 对硫磷水解酶（parathion hydrolase）的研究现状
• 6.1.1 活性位点
• 6.1.2 立体选择性和催化机理
• 6.1.3 三维结构
• 6.2 甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase,MPH）的研究现状
• 6.3 有机磷水解酶的定向进化
• 6.3.1 体外定向进化方法
• 6.3.2 定向进化对有机磷水解酶的研究
• 7 有机磷农药微生物降解的实用化探索
• 7.1 降解菌株的原位修复
• 7.2 工程菌株的构建及应用
• 7.3 酶制剂的研究
• 8 微生物降解有机磷农药的展望
• 第二章 毒死蜱的微生物降解研究进展
• 1 毒死蜱的主要物化性质及用途
• 2 毒死蜱的残留活性
• 3 毒死蜱的生态毒理
• 4 毒死蜱的降解机制
• 5 毒死蜱污染的生物修复技术
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章 污染环境中毒死蜱降解菌的分离及其多样性
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、培养基与试剂
• 1.2 降解菌株的分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 降解菌株的16S rDNA序列的测定和鉴定
• 1.4.1 菌体总DNA的提取
• 1.4.2 降解菌株16S rDNA的PCR扩增
• 1.4.3 PCR产物的T/A克隆
• 1.4.4 普通感受态细胞的制备和转化
• 1.4.5 质粒DNA的小量提取
• 1.4.6 16S rDNA序列测定
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定
• 1.6 降解菌ERIC-PCR指纹图谱的扩增
• 1.7 菌株对毒死蜱的降解能力比较
• 1.7.1 菌株的培养
• 1.7.2 菌株在液体培养基中对毒死蜱的降解
• 1.7.3 菌株在土壤中对毒死蜱的降解
• 1.8 毒死蜱含量的检测
• 1.9 毒死蜱中间产物TCP含量的检测
• 1.10 有机磷降解谱实验
• 2 结果与分析
• 2.1 环境样品中毒死蜱降解菌株的分离筛选
• 2.2 降解菌的菌落形态及生理生化特征
• 2.3 降解菌株的基因组DNA提取
• 2.4 降解菌株的系统发育地位
• 2.5 降解菌ERIC-PCR指纹图谱
• 2.6 降解菌的降解能力比较
• 2.6.1 菌株在液体培养基中对毒死蜱的降解
• 2.6.2 菌株在土壤中对毒死蜱的降解
• 2.6.3 菌株降解毒死蜱的途径分析
• 2.6.4 菌株对其它有机磷农药的降解
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第二章 毒死蜱降解关键基因的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 菌体总DNA的提取
• 1.4 质粒DNA的提取
• 1.5 感受态细胞的制备
• 1.6 产物的酶连、转化与阳性克隆的筛选
• 1.7 序列测定、比较与分析
• 1.8 有机磷水解酶基因的PCR扩增
• 1.9 有机磷水解酶基因表达载体的构建
• 1.9.1 PCR产物和pET29a载体双酶切
• 1.9.2 酶切产物的纯化、酶连、转化与筛选
• 1.10 重组酶的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 1.10.1 样品处理
• 1.10.2 聚丙烯酰胺凝胶的灌制
• 1.10.3 电泳
• 1.10.4 染色脱色
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR法克隆有机磷水解酶基因
• 2.2 序列测定与比较分析
• 2.2.1 基因水平上的比较
• 2.2.2 氨基酸序列水平上的比较
• 2.3 结构基因的表达与功能验证
• 2.3.1 表达载体构建
• 2.3.2 有机磷水解酶结构基因在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第三章 有机磷水解酶基因mpd的定向进化与功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 随机突变方法
• 1.3 酶活提高突变体的筛选
• 1.4 定点突变方法
• 1.4.1 突变引物
• 1.4.2 扩增体系
• 1.4.3 PCR反应条件
• 1.4.4 PCR产物酶连转化
• 1.5 序列测定与分析
• 1.6 酶的纯化
• 1.7 MPH酶活力测定方法
• 1.7.1 平板法定性测定MPH的活性
• 1.7.2 水解反应体系定量测定MPH的活性
• 1.8 蛋白质浓度的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 随机突变法获得对毒死蜱水解活力提高的突变体
• 2.2 突变体酶MPH-Mn7与wild-type MPH的动力学参数比较
• 2.3 定点突变
• 2.3.1 突变位点的选择
• 2.3.2 单位点突变体的构建
• 2.3.3 突变体MPH对毒死蜱降解的酶动力学分析
• 2.4 突变体酶结构的软件分析
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第四章 毒死蜱污染环境的生物修复研究
• 第一节 菌株Dsp-1发酵条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与菌株
• 1.2 最适培养条件的研究
• 1.2.1 单因素最适生长条件的测定
• 1.2.2 抗生素抗性试验
• 1.2.3 生长曲线测定
• 2 结果与分析
• 2.1 温度对菌株Dsp-1生长的影响
• 2.2 pH对菌株Dsp-1生长的影响
• 2.3 通气量对菌株Dsp-1生长的影响
• 2.4 不同碳源对菌株Dsp-1生长的影响
• 2.5 不同氮源对菌株Dsp-1生长的影响
• 2.6 无机离子对菌株Dsp-1生长的影响
• 2.7 C/N对Dsp-1生长的影响
• 2.8 Dsp-1对抗生素的耐受性
• 2.9 发酵培养基中生长曲线的测定
• 3 讨论
• 第二节 菌株Dsp-1对土壤中毒死蜱的降解
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养基
• 1.2 供试土壤
• 1.3 土壤处理与接种
• 1.4 土壤中毒死蜱的提取与测定
• 2 结果与分析
• 2.1 Dsp-1在灭菌和不灭菌的土壤对毒死蜱的降解
• 2.2 接种量对Dsp-1降解毒死蜱的影响
• 2.3 Dsp-1对土壤中不同浓度毒死蜱的降解
• 2.4 Dsp-1在不同类型土壤中对毒死蜱的降解效果
• 3 讨论
• 第三节 菌株Dsp-1对小青菜叶面毒死蜱残留的降解
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 试验方法
• 1.3 农药提取与检测
• 2 结果与分析
• 2.1 毒死蜱的添加回收率
• 2.2 Dsp-1降解冬季叶菜毒死蜱残留的结果
• 2.3 Dsp-1降解春季叶菜毒死蜱残留的结果
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 论文创新点总结
• 附录一：实验用培养基及分子生物学试剂
• 附录二：发明专利证书
• 攻读博士学位期间发表的论文目录
• 致谢