计算机辅助HSA-hGCSF融合蛋白的分子改造

论文摘要

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞,具有高度特异性的刺激中性白细胞系的功能。G-CSF作为药物分子已广泛应用于临床,其主要的不足有生物活性低、体内稳定性差和体内半衰期短等。本文设计G-CSF突变体期望提高G-CSF的生物活性,采用白蛋白融合表达技术提高G-CSF的体内稳定性,为长效G-CSF的研究创造条件。依据G-CSF的结晶结构信息,我们利用Swiss-pdb Viewer 3.7软件的同源建模功能构建出融合蛋白突变体的三维结构。在Hyper Chem软件中计算各融合蛋白突变体的单点能,并与突变前作比较。单点能计算显示,对远离活性位点的5个氨基酸残基进行的突变得到的结构分子能量最小。分析各突变体的G-CSF骨架结构与野生型G-CSF骨架结构的差异,表明那些能保留活性作用结构的突变体其突变位点均接近N端,与单点能计算结果综合分析,认为M8突变体生物特性与天然构象相似,活性位点的两个重要氢键（19-Glu-O与173-Tyr-O、22-Arg-N与238-His-O）得到保留。选取活性和半衰期有望提高的突变方案M8,将其在毕赤酵母系统中进行表达,并对融合蛋白进行了鉴定,验证理论计算的合理性和可行性。全合成人G-CSF基因突变体的序列（hG-CSFm）,插入克隆载体pBlu2KSP-HSA中,构建重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSFm。测序结果显示克隆得到的hG-CSFm基因与突变方案的序列完全一致。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组质粒,回收HSA-hGCSFm片段,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,构建表达载体pPIC9K- HSA-hGCSFm。经限制性酶切分析证明融合基因已经成功地插入到载体pPIC9k中,测序结果表明HSA-hGCSFm融合基因与预期的一致。表达载体经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,以MD平板进行初筛,得到的重组子进行诱导表达分析。将表达量较高的重组毕赤酵母进行表达产物鉴定和G-CSF活性分析,优化诱导时间和诱导剂浓度后,对融合蛋白进行初步的分离纯化。诱导表达筛选得到1株表达200 mg/L目标蛋白的重组菌32。Western杂交显示表达产物具有很好的HSA抗原性,分子量约84 kDa;NFS-60细胞/MTT比色法测定表达产物具有G-CSF的生物学活性,野生型融合蛋白的比活性为5×104IU/mg,突变后提高为1.5×106IU/mg,说明重组菌32可成功表达具有G-CSF生物活性的HSA-hGCSFm融合蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 分子模拟技术
• 1.1.1 分子模拟技术的兴起
• 1.1.2 结构模拟方法
• 1.1.3 结构优化方法
• 1.2 粒细胞集落刺激因子
• 1.2.1 粒细胞集落刺激因子概况
• 1.2.2 粒细胞集落刺激因子的生物学性质
• 1.2.3 粒细胞集落刺激因子基因和蛋白
• 1.2.4 粒细胞集落刺激因子生理活性及作用机理
• 1.2.5 粒细胞集落刺激因子的临床应用
• 1.3 长效重组蛋白
• 1.3.1 研究背景
• 1.3.2 构建突变体
• 1.3.3 PEG 化学修饰
• 1.3.4 基因融合
• 1.4 毕赤酵母表达系统
• 1.4.1 蛋白分泌作用
• 1.4.2 翻译后修饰作用
• 1.4.3 选择性启动子
• 1.4.4 基因整合方式
• 1.4.5 外源蛋白稳定性
• 1.5 立题背景及研究内容
• 第二章 融合蛋白的分子设计
• 2.1 GCSF 活性位点
• 2.1.1 GCSF 晶体结构
• 2.1.2 GCSF 活性位点
• 2.2 实验仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 GCSF 结构模拟
• 2.3.2 HSA-GCSF 结构模拟
• 2.3.3 HSA-GCSF 突变体结构模拟
• 2.4 结果
• 2.4.1 GCSF 结构模拟
• 2.4.2 HSA-GCSF 结构模拟
• 2.4.3 HSA-GCSF 突变体结构模拟
• 2.4.4 HSA-GCSFm 与GCSF 信号传导复合物的比较
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第三章 表达载体PPIC9K-HSA-HGCSFM的构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 工具酶
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 引物
• 3.1.6 主要仪器
• 3.2 方法
• m和pBlu2KSP-HSA 的提取'>3.2.1 质粒pUC57-hGCSF^m和pBlu2KSP-HSA 的提取
• m和pBlu2KSP-HSA 的SauI 和NotI 消化'>3.2.2 质粒pUC57-hGCSF^m和pBlu2KSP-HSA 的SauI 和NotI 消化
• m片段的纯化'>3.2.3 线性化pBlu2KSP-HSA 和hG-CSF^m片段的纯化
• m片段的连接'>3.2.4 线性化pBlu2KSP-HSA 和hG-CSF^m片段的连接
• 3.2.5 DH5α感受态细胞的制备及转化
• m的鉴定'>3.2.6 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF^m的鉴定
• m的序列测定'>3.2.7 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF^m的序列测定
• m的构建'>3.2.8 表达载体pPIC9K-HSA-hGCSF^m的构建
• 3.2.9 表达载体pPIC9K-HSA-hGCSFm的鉴定：参见3.2.6
• 3.3 结果
• m的构建'>3.3.1 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF^m的构建
• m的序列测定'>3.3.2 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF^m的序列测定
• m的构建'>3.3.3 表达载体pPIC9K-HSA-hGCSF^m的构建
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 毕赤酵母工程菌的构建与表达产物鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株、质粒、细胞株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 工具酶与试剂
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 论文总结
• 一、主要结论
• 二、存在问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文