含GFP报告基因的伪狂犬病病毒Ea株gG基因缺失重组病毒的构建

论文摘要

伪狂犬病病毒（Pseudorbies virus, PRV）属疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科中的猪疱疹病毒I型,它能导致多种家畜和野生动物发生急性传染病。猪是该病毒的贮存者和传染源,猪感染PRV后常表现为神经系统的功能紊乱和呼吸系统疾病并引起严重的繁殖障碍。该病已给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失,预防、控制并最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。采用安全有效的疫苗进行免疫预防,是控制该病的主要措施。本试验旨在构建含（GFP）报告基因的伪狂犬病病毒gG基因缺失表达载体。通过酶切、补平、连接的方法对PUSK载体质粒进行改造,消除了该载体上的BamHI和HindIII两酶切位点。并将改造后的PUSK命名为PUSBH。根据pAcGFP1-C1基因序列设计一对引物,分别在引物的上、下游5’端引入了NotI酶切位点,通过PCR扩增将目的基因AcGFP（包括GFP、CMV、MCS、SV40 Poly（A））克隆入pGEM-T-Easy载体内,构建了重组质粒。经酶切和PCR鉴定证明插入片段是AcGFP基因,并将重组质粒命名为pT-GFP。用NotI酶切重组质粒pT-GFP和载体PUSBH并回收,将载体去磷酸化后与目的片段AcGFP链接,通过PCR扩增、酶切、序列测定证明,该转移载体构建成功。并将其命名为PUSG。该转移载体含有四个单一酶切位点可供外源基因的插入,从而为构建以伪狂犬病毒作载体的二价或多价基因工程疫苗打下了基础。利用脂质体介导的方法,将转移载体质粒PUSG与PRV基因组DNA共转染PK-15细胞。于荧光显微镜下48h便能观察到绿色荧光,用吸管将有荧光的病变细胞吸出,经过三次连续传代得到了纯化病毒。并经过PCR和酶切鉴定重组病毒构建成功。重组病毒的获得为下一步研制二价或多价疫苗的筛选提供了方便。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 伪狂犬病病毒（PRV）研究进展
• 1.1.1 PRV 的病原学特性
• 1.1.2 PRV 基因组结构
• 1.1.3 伪狂犬病病毒诊断方法研究进展
• 1.1.3.1 病原学方法
• 1.1.3.2 血清学方法
• 1.1.3.3 强弱毒鉴别诊断
• 1.1.4 PRV 基因工程疫苗研究进展
• 1.1.4.1 PRV 基因缺失疫苗
• 1.1.4.2 PRV 活载体疫苗
• 1.2 绿色荧光蛋白（GFP）研究进展
• 1.2.1 GFP 的分子结构和发光机制
• 1.2.2 GFP的生化性质
• 1.2.3 影响GFP表达强度的因素
• 1.2.4 GFP 在生物学研究中的应用
• 1.2.5 展望
• 第二章 含（GFP）报告基因的伪狂犬病病毒转移载体的构建
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要溶液及试剂的配制
• 1.1.5 其它缓冲液
• 1.1.6 PCR 引物设计与合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 PUSK 质粒载体的改造
• 1.2.2 pAcGFP1-C1 质粒的转化、提取与鉴定
• 1.2.3 绿色荧光蛋白 AcGFP 基因的克隆
• 1.2.4 含绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒转移载体的构建
• 1.2.4.1 质粒载体（PUSBH）的酶切
• 1.2.4.2 酶切产物的回收
• 1.2.4.3 载体（PUSBH）的去磷酸化
• 1.2.4.4 外源目的片段（AcGFP）的酶切回收
• 1.2.4.5 载体（PUSBH）与外源片段（AcGFP）的链接
• 1.2.4.6 链接产物的转化、质粒提取及鉴定
• 1.2.4.7 重组表达质粒的鉴定
• 1.2.5 序列测定
• 2 结果
• 2.1 PUSK 质粒载体的改造
• 2.2 pAcGFP1-C1 质粒的鉴定
• 2.3 重组克隆质粒的 PCR 鉴定
• 2.4 含绿色荧光蛋白的伪狂犬病病毒转移载体的构建
• 2.5 序列测定
• 3 结论与讨论
• 3.1 关于 PUSK 载体的改造
• 3.2 绿色荧光蛋白基因（GFP）与其他几种报告基因的对比
• 3.3 重组克隆质粒酶切时的几点说明
• 3.4 抽提与胶回收纯化 DNA 的比较
• 3.5 关于伪狂犬病病毒转移载体及构建
• 3.6 关于 PRV gG 基因
• 4 小结
• 第三章 含（GFP）报告基因的伪狂犬病病毒基因缺失载体的表达
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞、病毒、质粒与菌株
• 1.1.2 酶和试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂和溶液的配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 细胞的准备
• 1.2.1.1 细胞的复苏
• 1.2.1.2 细胞的冻存
• 1.2.2 PRV 病毒的增殖与收获
• 1.2.3 病毒 DNA 的提取
• 1.2.4 重组转移载体质粒（PUSG）的提取
• 1.2.5 转染用细胞的准备
• 1.2.6 转移载体质粒（PUSG）DNA 与 PRV 基因组 DNA 的共转染
• 1.2.7 重组病毒的筛选与纯化
• 2 结果
• 2.1 病毒 DNA 的提取
• 2.2 转移载体质粒 DNA 的提取
• 2.3 转移载体质粒与病毒 DNA 的共转染
• 2.4 重组病毒的筛选与纯化
• 3 分析与讨论
• 3.1 关于病毒 DNA 的提取
• 3.2 关于转移载体质粒 DNA 的提取
• 3.3 转移载体质粒与病毒 DNA 共转染效率的优化
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要