构建携带IGF-1和GFP基因的柞蚕核型多角体病毒双启动子转移载体

论文摘要

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors，简称IGFs），又称类胰岛素样生长因子，是一类多功能细胞增殖调控因子。该家族中的胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1）是一种由70个氨基酸组成的分子量为7650Da的单链、肽类生长因子，具有广泛的生物学功能，对动物生长和消化道的发育具有重要作用，其研究前景非常广阔，但其天然含量少且提取困难，故市售价格昂贵。因此，希望将IGF-1运用昆虫杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector system，简称BEVS）在柞蚕蛹中进行表达，将蛹直接粉碎即可作为饲料添加剂使用。本研究的目的是构建带有IGF-1基因和绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，简称GFP）基因的柞蚕核型多角体病毒双启动子转移载体。本实验首先根据苜蓿银纹夜蛾和家蚕的核型多角体病毒IE-1基因上游序列，设计同源引物，克隆了柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子片段，并与最近登陆在Gene Bank的同源序列比对，结果显示同源性极高，与家蚕和斜纹夜蛾多角体病毒的IE-1启动子相比，具有早期基因启动子特点。将IE-1基因启动子插入到质粒pGFP-N2的GFP基因上游，构建了IE-1／pGFP-N2表达载体。通过转染Hela细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达，证明克隆的启动子具有转录活性，表达载体构建成功。IE-1基因启动子是杆状病毒的极早期基因启动子，侵入细胞后就会迅速激活下游基因表达，有利于快速简便的筛选重组病毒。其次，选取SV40 polyA作为IGF-1的终止序列，通过PCR对其扩增并构建了它的克隆载体pMD-SV40 polyA；以IE-1／pGFP-N2为模版，扩增带有IE-1基因启动子的GFP，使扩增的Pie-GFP两端带有EcoRⅠ酶切位点，构建出pMD-Pie-GFP克隆载体。因为IGF-1为小分子肽类活性物质，为了提高它的表达量，构建了IGF-1串联拷贝数分别为一至四的多拷贝克隆载体pUC-IGF-1（1-4）-SV40 polyA，本实验利用BamHⅠ和BglⅡ是同尾酶，它们作用酶切位点后产生相同的粘性末端序列，并且连接后酶切位点消失的原理，逐步插入IGF-1得到多拷贝克隆载体。最后，以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切IGF-1拷贝数分别为一至四的克隆载体，以EcoRⅠ酶切pMD-Pie-GFP，回收IGF-1（1-4）-SV40 polyA和Pie-GFP，将这两段基因插到已有的柞蚕核型多角体病毒转移载体pApM的多克隆位点上，其中IGF-1在pApM的多角体基因启动子下游，Pie-GFP在IGF-1之后，构建出带有IGF-1基因和GFP基因的柞蚕核型多角体病毒双启动子转移载体。PCR法筛选出Pie-GFP插入方向正确的双启动子转移载体，该转移载体的突出特点是在筛选重组病毒时，有重组病毒的细胞在荧光显微镜下呈绿色，具有明显的选择标记，使筛选工作简化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 胰岛素样生长因子及其研究现状
• 1.2 胰岛素样生长因子的组成及生理作用
• 1.2.1 IGF-1和IGF-2
• 1.2.2 IGF-1和IGF-2/M-6-p（6-磷酸甘露醇）受体
• 1.2.3 胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）
• 1.2.4 IGF的生物学作用
• 1.2.5 口饲IGF-1对动物胃肠道功能的影响
• 1.3 杆状病毒的研究进展
• 1.3.1 杆状病毒的简介
• 1.3.2 杆状病毒基因的表达调控
• 1.3.3 杆状病毒表达载体研究进展
• 1.3.4 杆状病毒表达系统的建立及其原理
• 1.3.5 晚期基因启动子构建转移载体
• 1.3.6 早期启动子（IE）的研究进展
• 1.3.7 早期启动子载体的发展
• 1.3.8 柞蚕NPV载体表达系统的特点
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆与分析
• 2.1 实验材料和主要仪器
• 2.1.1 病毒、细胞、菌种和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 柞蚕核型多角体病毒DNA的提取
• 2.2.2 引物的设计
• 2.2.3 柞蚕IE-1基因启动子的克隆
• 2.2.4 IE-1启动子的测序分析
• 2.2.5 表达载体的构建
• 2.2.6 转染用质粒的提取与精制
• 2.2.7 转染Hela细胞
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 提取的病毒基因组
• 2.3.2 PCR及连接pMD18-T克隆载体结果
• 2.3.3 启动子的序列分析
• 2.3.4 与其它IE-1基因转录起始区域的序列比对分析
• 2.3.5 表达载体的构建
• 2.3.6 重组质粒IE-1/pGFP-N2在Hela细胞中的表达
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 带有IGF-1和GFP的杆状病毒双启动子转移载体的构建
• 3.1 实验材料和主要仪器
• 3.1.1 酶和试剂
• 3.1.2 载体和菌株
• 3.1.3 主要实验器材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒DNA的提取
• 3.2.2 限制性酶切反应
• 3.2.3 从反应液中回收PCR产物
• 3.2.4 从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段
• 3.2.5 线性DNA片段末端的去磷酸化
• 3.2.6 DNA的连接
• 3.2.7 感受态细胞的制备
• 3.2.8 质粒的转化
• 3.2.9 引物设计
• 3.3 载体的构建策略
• 3.3.1 SV40 polyA克隆载体的构建
• 3.3.2 单拷贝IGF-1克隆载体的构建
• 3.3.3 用于多拷贝的IGF-1克隆载体构建
• 3.3.4 多拷贝IGF-1基因克隆载体的构建
• ie-GFP克隆载体的构建'>3.3.5 P_ie-GFP克隆载体的构建
• 3.3.6 双启动子转移载体的构建
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 SV40 polyA克隆载体的构建
• 3.4.2 单拷贝IGF-1克隆载体的构建
• 3.4.3 用于多拷贝的IGF-1克隆载体构建
• 3.4.4 多拷贝IGF-1基因克隆载体的构建
• ie-GFP克隆载体的构建'>3.4.5 P_ie-GFP克隆载体的构建
• 3.4.6 双启动子转移载体的构建
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 4 结论
• 4.1 主要结论
• 4.2 进一步需要开展的工作
• 4.3 创新
• 4.4 展望
• 附录 DNA Marker
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢