棉花细胞质雄性不育恢复基因的图位克隆及PPR基因家族的分析

论文摘要

植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS）.是一种不能产生有活力花粉的遗传现象,属母性遗传,在植物杂种优势利用中具有重要价值.利用胞质雄性不育系及恢复系和保持系的三系配套制种方式具有省工、方便、种子纯度高、成本较低等优点,将成为杂种棉商业化制种最有效的途径之一.棉花不仅是世界上最重要的天然纤维和重要的油料作物,而且也是一种重要的生物能源.棉花杂种优势十分明显,可有效提高产量、纤维品质与抗病、抗逆性.棉花由于“三系”中的恢复系存在恢复力不强的缺陷使得棉花CMS的应用受到极大的限制,“三系法”制种仍未实现产业化.因此,克隆棉花细胞质雄性不育育性恢复基因对于研究细胞质雄性不育机理,培育优良恢复系,更好的利用杂种优势具有重要的理论和实践意义.目前已克隆的恢复基因中,除了玉米Rf2编码乙醛脱氢酶外,矮牵牛Rf,萝卜Rf0及水稻的Rf1a和Rf1b都编码的是由PPR基序串联组成的PPR蛋白.PPR基因家族是近年来新发现的一个家族,同时也是植物中最大的家族之一.它编码一种以35个简氨基酸为重复单位串连排列组成的蛋白质,这些重复单元能形成一个超螺旋从而特异的与单链RNA结合.PPR蛋白在细胞器形成和植物发育的许多方面起着重要的调控作用。目前,在许多真核生物中都已经发现了PPR基因,但棉花上还没有关于PPR基因的报道.本研究选用本室根据GenBank棉花EST数据库中的序列开发设计的2803对EST-SSR引物采用基因型代表群分析法对亲本不育系104-7A和恢复系0-613-2R及22株小群体进行筛选,将选中的6对引物对613株BCl群体进行扩增,共筛选到6个与Rf1基因紧密连锁的分子标记.通过整合本室先前构建的助遗传图谱上的原有标记,利用Joinmap3.0作图软件对恢复基因进行精细定位,整合后的图谱含有18个标记（2个RAPD、3个STS标记和13个SSR标记）,总遗传距离为0.65cM.本研究所获得的6个与Rf1紧密连锁的EST-SSR标记（NAU2650、NAU2924、NAU3205、NAU3652、NAU3938和NAU4040）表现为共分离,均与Rf1基因相距0.327cM,其中NAU3205为显性标记,其它5个都是共显性标记.利用6.个与助紧密连锁的EST-SSR标记对本室构建的0-613-2R恢复系BAC文库进行PCR筛选。先对二级混合克隆文库进行PCR筛选,筛选到阳性混合克隆后,再对一级混合克隆库进行筛选,最终得到阳性单克隆.6个EST-SSR标记共筛选到7个阳性BAC单克隆,其中NAU4040未筛选到阳性克隆,NAU3938筛选到3个阳性克隆,其它标记各筛选到1个阳性克隆,NotⅠ酶切检测其插入片段大小范围为105-130kb.将本室已获得的与Rf1相关的克隆整合后在助遗传图谱上的18对引物共获得56个阳性BAC克隆.选取助图谱上两侧最近的13个标记所筛选到的31个阳性BAC进行HindⅢ酶切指纹分析,利用Image3.10b和FPC V7.2软件对HindⅢ酶切图谱进行分析后构建Rf1区域的精细物理图谱.利用萝卜、矮牵牛和水稻恢复基因编码的蛋白序列分别作为查询探针对GenBank中棉花ESTs数据库进行tblastn扫描,对获得的所有ESTs利用CAP3软件组装并通过blastx预测每个contig的功能,获得三个与萝卜、矮牵牛和水稻恢复基因同源性较高的contigs。根据这三个contigs的序列设计特异引物对物理图谱上的所有BAC进行筛选,其中根据contig2设计的引物筛选到一个克隆Y43。综合物理图谱与同源序列分析的结果,将棉花Rf1基因定位在BACY43上并对该BAC全长测序.对获得的BAC序列进行基因预测,共获得24个ORF,其中4个ORF（ORF2、ORF3、ORF7和ORF18）编码PPR蛋白并含有线粒体定位信号。通过4个ORF的序列比对及对恢复系和不育系的测序比较,推断ORF3为助基因候选ORF.为了了解陆地棉中PPR基因的分布和数量,本研究从147个陆地棉BAC中找到6个编码PPR蛋白的ORF,同时利用其它植物中已克隆的18个PPR基因编码的蛋白作为tblastn比对的查询探针,对GenBank中陆地棉EST数据库进行扫描,通过CAP3组装拼接鉴定出309个PPR unigene。为进一步研究陆地棉中PPR基因编码的蛋白结构和表达特点,以陆地棉0-613-2R为材料通过RT-PCR的方法克隆了5个PPR基因的全长cDNA序列,分别将它们命名为GhPPR1-GhPPR5,对其基因组结构分析发现它们都不含有内含子,ORF长度从867-1779 bp。结构域分析显示这5个PPR基因编码的氨基酸分别包含5-10个PPR重复单元,其中GhPPR1和GhPPR2属于PLS亚家族,GhPPR3-GhPPR5属于P亚家族,同时这5个基因与18个其它植物中的PPR基因的进化分析也显示同一亚家族中的成员聚集在一起。本研究还利用实时荧光定量PCR对这5个PPR基因在陆地棉不同组织和器官中的表达进行了分析,结果显示5个基因在根、茎、叶、花粉以及纤维中都表达,但在不同时期的相对表达量略有不同。育性基因的分离克隆一直是人们关心的课题,它对于认识不育性机理,揭示生命现象以及更有效地利用杂种优势都有着十分重要的意义。本研究利用图位克隆和同源序列克隆两种方法相结合的策略,在构建Rf1精细遗传图谱和物理图谱的基础上,根据恢复基因同源序列设计引物对物理图谱上的BAC克隆进行扫描,鉴定出包含Rf1基因的BAC克隆并对其全长测序,通过基因预测和特征分析及亲本序列差异分析获得了Rf1的候选ORF.棉花CMS育性恢复基因的成功克隆,可以通过转基因方法,培育具有优良性状的新型恢复系,可实现棉花杂种优势利用的重大突破,从而极大地推动我国棉花育种和生产的发展。同时,获得具有自主知识产权的棉花CMS育性恢复基因,可以更好地保护我国的基因资源。本研究还有助于揭示棉花细胞质雄性不育的分子机理,为进一步研究和利用棉花杂种优势奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用主要缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 细胞质雄性不育与恢复基因研究进展
• 1 植物细胞质雄性不育
• 1.1 植物细胞质雄性不育的类型
• 1.2 植物细胞质雄性不育与细胞质遗传系统
• 1.2.1 叶绿体基因组与细胞质雄性不育
• 1.2.2 线粒体基因组与细胞质雄性不育
• 1.2.2.1 玉米
• 1.2.2.2 水稻
• 1.2.2.3 矮牵牛
• 1.2.2.4 油菜
• 1.2.2.5 高粱
• 1.3 细胞质雄性不育的发育调控机理假说
• 2 植物CMS育性恢复基因研究进展
• 2.1 玉米
• 2.2 矮牵牛
• 2.3 萝卜
• 2.4 水稻
• 3 棉花细胞质雄性不育及其恢复基因研究进展
• 第二章 PPR基因家族研究进展
• 1 PPR基因家族的结构特点
• 2 PPR基因家族在染色体上的分布及其在不同生物中的数量
• 2.1 PPR基因在染色体上的分布
• 2.2 PPR基因在不同生物中的分布
• 3 PPR蛋白的功能
• 3.1 PPR蛋白对叶绿体和线粒体基因的调控作用
• 3.2 PPR蛋白参与植物细胞质雄性不育系统的育性恢复过程
• 3.3 PPR蛋白作为反式作用因子参与植物特异的RNA编辑过程
• 3.4 PPR蛋白影响高等植物的胚胎发生
• 第三章 植物基因克隆技术研究进展
• 1 图位克隆
• 1.1 目标基因的精细定位
• 1.1.1 RAPD
• 1.1.2 SSR
• 1.1.3 STS
• 1.1.4 SNP
• 1.2 构建含有大插入片段的基因组文库
• 1.3 构建目标区域的物理图谱
• 1.4 目的基因的筛选和鉴定
• 2 转座子或T-DNA标签法
• 3 功能克隆
• 3.1 根据基因表达的蛋白质
• 3.2 根据基因的表型突变互补功能
• 3.3 酵母双杂交
• 4 差异表达克隆
• 4.1 mRNA差异显示
• 4.2 抑制消减杂交
• 5 同源序列克隆技术
• 6 电子克隆
• 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第四章 棉花CMS育性恢复基因的图位克隆
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 分子标记种类及其来源
• 1.2.1 SSR标记
• 1.2.2 RAPD标记
• 1.2.3 STS标记
• 1.3 BAC文库
• 1.4 菌株和质粒
• 1.5 酶和试剂
• 1.6 网络资源及应用软件
• 1.7 引物
• 2 方法
• 2.1 育性调查
• 2.2 棉花基因组DNA的提取方法
• 2.3 分子标记分析
• 2.3.1 SSR分析
• 2.3.1.1 微卫星的PCR扩增
• 2.3.1.2 PAGE/银染分析
• 2.3.2 RAPD分析
• 2.3.2.1 RAPD扩增
• 2.3.2.2 RAPD产物检测
• 2.3.3 STS分析
• 2.3.3.1 STS扩增
• 2.3.3.2 STS产物检测
• 2.4 遗传图谱的构建
• 2.5 PCR法筛选BAC文库
• 2.6 BAC质粒DNA的微量提取
• 2.6.1 单个离心管提取BAC质粒DNA
• 2.6.2 96孔板提取BAC质粒DNA
• 2.7 物理图谱构建
• 2.7.1 NotⅠ酶切检测阳性克隆的插入片段
• 2.7.2 阳性克隆的HindⅢ酶切指纹图谱分析
• 2.7.3 重叠群的构建
• 2.8 棉花恢复基因同源EST的检索和分析
• 1BAC克隆的确定与全长测序'>2.9 包含Rf₁BAC克隆的确定与全长测序
• 2.10 感受态细胞的制备及大肠杆菌的转化
• 2.10.1 感受态细胞的制备
• 2.10.2 大肠杆菌的转化
• 2.11 扩增产物的电泳,回收,克隆及测序
• 3 结果与分析
• 3.1 BC1群体遗传分析
• 3.2 分子标记分析
• 3.2.1 EST-SSR多态性的筛选
• 1的精细定位'>3.2.2 恢复基因Rf₁的精细定位
• 3.2.3 分子标记来源及特征带大小
• 3.3 6个EST-SSR的源EST序列分析
• 3.4 EST-SSR标记的BAC文库筛选
• 3.5 恢复基因助位点物理图谱的构建
• 3.5.1 阳性克隆的HindⅢ酶切指纹分析
• 3.5.2 重叠群的构建
• 3.6 利用同源克隆法对棉花EST数据库中恢复基因同源EST的组装及分析
• 1基因BAC克隆的确定及Rf₁候选ORF的筛选'>3.7 包含Rf₁基因BAC克隆的确定及Rf₁候选ORF的筛选
• 1候选ORF验证'>3.8 Rf₁候选ORF验证
• 4 讨论
• 4.1 育性恢复基因紧密连锁标记的应用
• 4.2 利用图位克隆与同源克隆相结合的策略克隆棉花的CMS育性恢复基因
• 4.3 棉花助基因是PPR基因家族成员
• 4.4 恢复基因的进化及育性恢复机理探讨
• 第五章 陆地棉5个PPR基因家族成员的克隆和特征分析
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 引物
• 2 方法
• 2.1 陆地棉中PPR基因的分析和鉴定
• 2.1.1 从基因组水平的预测分析和鉴定PPR基因
• 2.1.2 从EST水平检索与PPR蛋白同源的陆地棉EST并进行组装与分析
• 2.2 感受态细胞的制备及大肠杆菌的转化
• 2.3 棉花总RNA的提取及DNaseI消化
• 2.3.1 实验前准备
• 2.3.2 CTAB-酸酚法
• 2.3.3 DNasell消化
• 2.4 TR-PCR分析
• 2.4.1 cDNA第一链的合成
• 2.4.2 RT-PCR
• 2.5 扩增产物的电泳,回收,克隆及测序
• 2.6 实时荧光定量RT-PCR分析
• 2.6.1 实时荧光定量RT-PCR引物的特异性检测
• 2.6.2 实时荧光定量RT-PCR反应
• 3 结果与分析
• 3.1 NCBI陆地棉数据库中PPR基因家族分析
• 3.1.1 陆地棉BAC序列中PPR基因家族的预测
• 3.1.2 陆地棉EST数据库中PPR基因家族的预测
• 3.2 5个GhPPR基因的克隆和基因组结构分析
• 3.3 5个GhPPR基因的特征分析
• 3.4 5个GhPPR基因的时空表达分析
• 3.5 GhPPR蛋白和其它植物PPR蛋白的系统进化分析
• 3.6 5个GhPPR基因在恢复系和不育系的RT-PCR分析
• 4 讨论
• 4.1 陆地棉PPR基因家族的预测
• 4.2 5个陆地棉GhPPR基因的电子克隆
• 4.3 陆地棉PPR基因家族的结构与功能
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表论文