抗逆相关基因GM和口蹄疫结构蛋白全长P1基因转化大豆的研究

论文摘要

本研究成功地探讨出了一套由大豆未成熟子叶诱导体细胞胚,继而分化成大豆植株的组织培养体系,建立了完备的遗传转化受体系统。利用改进的冻融法和电击法将pRdGM-200 双元表达载体导入了农杆菌中,为利用农杆菌介导法转化大豆提供了载体系统。以10 余个东北地区主栽的大豆品种未成熟子叶和体细胞胚为受体材料,通过农杆菌介导和基因枪法,将抗逆相关GM 基因和编码口蹄疫病毒结构蛋白全长基因P1 导入大豆基因组中,获得了抗性植株,经PCR、PCR-southern 杂交和基因组DNA 点杂交等分子生物学方法检测,证明目的基因已整合到大豆基因组中。为进一步探索提高和改善大豆抗逆性方面的研究,筛选出抗逆的大豆新品种奠定了基础,为利用大豆作为生物反应器生产口蹄疫新型口服疫苗提供了参考依据。

论文目录

• 第一篇 文献综述
• 1 植物基因工程的发展现状、前景及存在的问题
• 1.1 植物基因工程的发展现状
• 1.2 植物基因工程的遗传转化方法
• 1.3 植物基因工程应用性进展
• 1.3.1 提高产量和品质的植物基因工程
• 1.3.2 抗虫的植物基因工程
• 1.3.3 抗除草剂的植物基因工程
• 1.3.4 抗病毒的植物基因工程
• 1.3.5 用于医药生产的植物基因工程
• 1.4 植物基因工程的发展前景
• 1.5 植物基因工程存在的问题
• 1.5.1 植物基因工程存在的技术问题
• 1.5.2 植物基因工程存在的潜在应用问题
• 2 大豆基因工程的现状及发展前景
• 2.1 大豆再生体系研究进展
• 2.1.1 大豆体细胞胚胎发生再生系统
• 2.1.2 大豆器官发生再生系统
• 2.1.3 原生质体再生系统
• 2.2 大豆遗传转化研究进展
• 2.2.1 农杆菌介导法（agrobacterium-mediated）
• 2.2.2 基因枪法（particle gun）
• 2.2.3 原位转化法
• 2.2.4 聚乙二醇（PEG）介导法
• 2.2.5 电击法（Electroporation）
• 2.2.6 花粉管通道法（Direct introduction exogenous DNA,DIED）
• 2.2.7 显微注射法（Microinjection）
• 2.3 大豆转基因研究的发展方向
• 3 抗逆性改良的基因工程
• 3.1 植物对逆境胁迫的适应性
• 3.2 逆境胁迫诱导基因的调控与表达
• 3.3 耐盐、抗旱机制
• 3.4 一些已分离和鉴定的抗逆基因作用机理
• 3.5 通过基因转移改良植物抗逆性
• 3.6 DREB 转录因子基因及其应用
• 4 Bar 基因和转Bar 基因作物的研究进展
• 4.1 Bar 基因和转Bar 基因作物的研究现状
• 4.2 Bar 基因在作物遗传育种上的应用
• 5 植物反应器与植物疫苗
• 5.1 植物反应器
• 5.2 植物疫苗
• 5.3 口蹄疫疫苗的研究进展
• 第二篇 试验内容
• 第一章 将携带抗逆相关基因质粒pRdGM-200 向农杆菌转化的研究
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 PCR 引物
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 工程菌液培养基
• 2 方法
• 2.1 质粒DNA 的小量提取
• 2.2 pRdGM-200 质粒的农杆菌转化
• 2.2.1 冻融法
• 2.2.2 电击法
• 2.3 转化菌株的鉴定
• 2.3.1 PCR 鉴定
• 2.3.2 酶切鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 冻融法转化农杆菌菌株的获得
• 3.1.1 不同生长时期细胞对转化率的影响
• 3.1.2 感受态农杆菌细胞处理方式对转化率的影响
• 3.2 电击法转化农杆菌菌株的获得
• 3.2.1 不同电场强度对转化效率的影响
• 3.2.2 脉冲持续时间对转化效率的影响
• 3.2.3 不同生长时期细胞对电转化率的影响
• 3.3 农杆菌重组子检测
• 3.3.1 PCR 检测结果
• 3.3.2 酶切检测结果
• 4 讨论
• 第二章 利用农杆菌介导法将抗逆相关的GM 基因导入大豆的研究
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 酶及生化试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 大豆遗传转化体系
• 2.2 农杆菌的侵染及筛选
• 2.3 转基因植株的耐旱耐盐性鉴定
• 2.4 抗性植株的分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 农杆菌转化大豆未成熟子叶遗传转化体系的建立
• 3.2 耐旱耐盐性鉴定
• 3.3 抗性植株的分子检测
• 4 讨论
• 第三章 用基因枪法将抗逆相关的GM 基因导入大豆的研究
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 供试质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 主要设备
• 2 方法
• 2.1 植物材料诱导及处理
• 2.2 质粒DNA 的大量提取与纯化
• 2.3 基因枪轰击
• 2.4 抗性体细胞胚筛选及植株再生
• 2.5 抗性植株的检测
• 3 结果和分析
• 3.1 抗性筛选剂PPT 浓度的确定
• 3.2 抗性植株PCR 检测
• 3.3 抗性植株 PCR-southern 杂交结果
• 4 讨论
• 第四章 农杆菌介导法将FMDV 全长基因P1 导入大豆的研究
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 酶和生化试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 大豆未成熟子叶的转化
• 2.2 抗性植株的检测与鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR 鉴定结果
• 3.2 阳性植株 PCR-southern 杂交鉴定结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 图版
• 附录Ⅱ 图版说明