胶原模型肽的分子标记与其三螺旋的折叠/解折叠研究

论文摘要

胶原蛋白是动物及人体内含量最丰富的蛋白质,它不仅是广泛存在于结缔组织的重要结构蛋白,还在细胞分化、组织再生等过程中担任关键角色。胶原蛋白的特殊三股螺旋结构与功能,一直是蛋白质领域研究的热点。分子标记技术在生物化学中也已经广泛应用,但是利用分子标记技术对胶原蛋白的结构与功能的研究较少。所以,此课题研究的目的是将荧光素和氮氧自由基等功能分子作为胶原三螺旋的探针来研究胶原肽三螺旋折叠／解折叠过程的分子动力学规律,从而拓展该方法在胶原蛋白或其他蛋白质折叠动力学领域中的应用。由于胶原纤维大分子的研究限制,利用多种胶原模型肽来研究胶原蛋白的性质已成为广泛而有效地策略。我们设计并合成了全新的功能化胶原模型肽,即将天然胶原肽中一个4-羟基脯氨酸替换为4-氨基脯氨酸,然后通过其侧链氨基与标记分子羧基的酰胺化反应分别引入荧光素、氮氧自由基和半乳糖酸等功能性标记小分子。随后采用热动力学圆二色谱、电子顺磁共振谱、荧光光谱等波谱学研究三螺旋折叠／解折叠过程对荧光淬灭、自由基顺磁共振信号的影响和三螺旋稳定性的变化。我们通过引入双保护4-氨基脯氨酸首次合成了含一个氨基脯氨酸的主客体模型肽和含各种功能标记分子的胶原标记肽,它们接近天然状态,适合波谱学研究。我们初步得到胶原肽三螺旋折叠／解折叠的动力学规律,荧光强度和顺磁共振强度随着解旋先增加后减弱以及糖基化可以增强三螺旋稳定性的结论。这些方法拓展了分子标记技术在生物学中的应用,并且可以为研究胶原蛋白的结构功能及设计新的胶原样生物医学与纳米材料提供了进一步的理论指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 胶原蛋白
• 1.2 胶原三螺旋的结构与稳定性
• 1.2.1 链间氢键
• 1.2.2 氨基酸序列
• 1.2.3 空间效应与立体电子效应
• 1.3 胶原模型肽
• 1.3.1 胶原模型肽结构研究
• 1.3.2 胶原模型肽的热稳定性
• 1.3.3 折叠/解折叠研究
• 1.4 蛋白质的专一位点修饰与标记
• 第二章 立题依据与实验设计
• 2.1 立题依据
• 2.2 实验设计
• 2.2.1 合成胶原模型肽
• 2.2.2 合成3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-N-氧自由基分子
• 2.2.3 合成2,3,4,6-四-0-乙酰基-α-D-半乳糖酸
• 2.2.4 合成化学标记的胶原模型肽
• 2.2.5 胶原模型肽与标记肽的折叠/解折叠动力学研究
• 2.3 本项目的特色与创新之处
• 第三章 实验内容与结论
• 3.1 仪器与材料
• 3.1.1 实验仪器与设备
• 3.1.2 实验材料与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 胶原模型肽的合成与制备
• 3.2.2 3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-N-氧自由基的合成
• 3.2.3 2,3,4,6-四-0-乙酰基-α-D-半乳糖酸的合成
• 3.2.4 化学标记胶原肽的合成
• 3.2.4.1 合成荧光标记肽
• 3.2.4.2 合成自旋标记肽
• 3.2.4.3 合成糖基化标记肽
• 3.2.4.4 标记肽的纯化制备与鉴定
• 3.2.5 荧光光谱研究（针对荧光标记肽）
• 3.2.6 EPR谱（针对自旋标记肽）
• 3.2.7 CD谱
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 合成标记小分子、胶原模型肽与各种标记肽的结果
• 3.3.2 胶原模型肽与各种标记肽的光谱学研究结果
• 3.3.2.1 荧光标记肽的荧光光谱分析
• 3.3.2.2 自旋标记肽的EPR谱分析
• 3.3.2.3 胶原模型肽与各种标记肽的CD谱分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 创新型胶原模型肽与胶原三螺旋的稳定性
• 3.4.2 位点专一性标记技术与胶原三螺旋
• 参考文献
• 个人简介
• 参与课题
• 致谢
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