兼性嗜热古地分枝杆菌X7C脱有机硫关键酶黄素还原酶的纯化和性质分析

论文摘要

化石燃料中含有的硫成分,在燃烧后转化成二氧化硫进入空气,是造成污染的重要原因之一。目前,加氢脱硫（Hydrodesulfurization,HDS）是在工业上应用的比较常规的脱硫方法,此方法是个高温加氢催化过程,可以有效地脱除无机硫和简单的有机硫成分,但却很难脱除石油中大量的多聚环结构的有机硫,随着低硫限制的提高,已经不能满足人们要求。而新近兴起生物催化法脱硫（Biodesufurization,BDS）,在常温下即可进行,并且对有机硫分具有高专一性,这使得BDS方法成为一种可供选择的方法,和HDS方法一起进行石油的脱硫。本课题组筛选获得能够在45℃条件下生长的一株古地分枝杆菌,短杆状,大小为0.3～0.5×2.0～3.0μm;革兰氏染色不易着色,通常为弱阳性;抗酸染色阳性,不运动,无孢子和荚膜;菌株细胞壁含有谷氨酸,丙氨酸和消旋二氨基庚二酸;主要的细胞壁糖为阿拉伯糖,半乳糖;可以在麦康凯培养基生长,不生成结晶紫,并且能抗5%NaCl。并且古地分枝杆菌X7C使用超声波破碎后,黄素还原酶酶活的情况,比红球菌IGTS8的酶活要高。 由于是胞内酶体系,因此首先使用超声波破碎的方法释放出胞内蛋白,之后参考过去的经验进行了大幅度改进,重新优化了硫酸铵沉淀的条件,并且在经过鱼精蛋白沉淀,硫酸铵分级沉淀后先后使用两次Butyl-Sepharose FF层析,分子筛Sephadex G-100和Superdex 75层析,以及离子交换Q-Sepharose FF层析。最后得到了电泳纯的单带,虽然得率只有1.9%,但是却满足了N端测序的要求,测得N端序列为VNQQQADKM,在GenBank上Blast后发现与已收录的蛋白质序列没有任何同源性,因此需要采用基因组文库筛选的方法来获得基因。 通过对纯化出的DszD酶的性质测定,可以看出这个酶在pH8.0,45℃酶活达到最大,属于兼性耐高温的酶。与IGTS8中的DszD不同,此酶除了作用于NADH和FMN之外,还可以作用于NADPH和FAD。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 脱硫概述
• 1.1.2 生物脱硫方法简介
• 1.1.3 微生物脱有机硫相关酶学以及分子机理研究
• 1.1.4 黄素还原酶领域的研究
• 1.2 研究前景与展望
• 第二章 脱硫菌株鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 主要仪器和试剂
• 2.2.3 培养基和缓冲液及其它试剂
• 2.2.4 生理生化性质测定
• 2.2.5 细胞破碎
• 2.2.6 黄素还原酶活力的测定
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 菌株的简单性质
• 2.3.2 微板光谱仪条件下的 NADH浓度和吸光度的关系
• 2.3.3 粗酶液破碎
• 2.4 小结
• 第三章 黄素还原酶的酶纯化
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株和培养基
• 3.2.2 主要仪器和试剂
• 3.2.3 缓冲液及其它试剂配制
• 3.2.4 蛋白质浓度测定方法
• 3.2.5 黄素还原酶酶活测定方法
• 3.2.6 电泳方法
• 3.2.7 电泳染色方法
• 3.2.8 粗酶液制备
• 3.2.9 硫酸鱼精蛋白沉淀
• 3.2.10 硫酸钱沉淀
• 3.2.11 Butyl-Sepharose FF柱层析
• 3.2.12 分子筛柱层析
• 3.2.13 阴离子层析
• 3.2.14 SDS-PAGE电泳
• 3.2.15 电泳样品处理
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 蛋白质浓度标准曲线绘制
• 3.3.2 硫酸鱼精蛋白沉淀
• 3.3.3 硫酸钱沉淀
• 3.3.4 Butyl-Sepharose FF柱层析
• 3.3.5 分子筛柱层析
• 3.3.6 离子交换层析
• 3.3.7 最终纯化结果简表
• 3.3.8 SDS-PAGE结果
• 3.4 小结
• 第四章 黄素还原酶的性质测定
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株和培养基
• 4.2.2 主要仪器和试剂
• 4.2.3 温度对酶活以及酶稳定性的影响
• 4.2.4 pH对酶活的影响
• 4.2.5 各种金属离子对酶活的影响
• 4.2.6 不同底物对酶活的影响
• m值的测定'>4.2.7 底物 K_m值的测定
• 4.2.8 N端序列测定
• 4.2.9 分子筛层析测定相对分子质量
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 温度对酶活以及酶稳定性的影响
• 4.3.2 pH对酶活的影响
• 4.3.3 各种金属离子对酶活的影响
• 4.3.4 不同底物对酶活的影响
• m值的测定'>4.3.5 底物 K_m值的测定
• 4.3.6 N流序列测定以及简并引物的设计
• 4.3.7 分子筛层析测定相对分子量
• 4.4 小结
• 第五章 基因组文库的建立和黄素还原酶基因的筛选
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌株和培养基
• 5.2.2 主要仪器和试剂
• 5.2.3 基因组提取方法
• 5.2.4 基因组的 Sau3AI部分酶切消化
• 5.2.5 回收所需要片段（4-6 kb）
• 5.2.6 载体pUC19的处理
• 5.2.7 连接转化
• 5.2.8 原位杂交和 Southern杂交
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 X7C基因组的提取和不完全酶切消化
• 5.3.2 载体的处理
• 5.3.3 连接转化
• 5.3.4 原位杂交初筛结果
• 5.4 小结
• 参考文献
• 论文
• 致谢