HIF-1α对人脐静脉内皮细胞增殖信号通路的初步研究

论文摘要

研究背景： 人类第一杀手——冠心病是由于冠脉血管病变导致心肌细胞缺血、缺氧，使该支冠脉血管（包括微循环）及所支配区域的心肌细胞凋亡、坏死，血运重建是其治疗的关键所在。人们正在致力于寻求血运重建方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，采用基因治疗促血管新生以改善缺血心肌的血供（也称分子搭桥术），成为目前冠脉血运重建术中比较具有发展前景的方向。机体在许多生理和病理状态下均可发生血管新生（angiogenesis），它是指从原有毛细血管基础上长出新血管的生物学过程。在血管新生的过程中参与的基因主要有：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等，它们参与了血管内皮细胞的分化、增殖、血管形成及成熟。这些基因已经初步应用于临床治疗，虽然Ⅰ期临床试验的结果证明安全有效，但Ⅱ期临床试验结果并不理想。资料显示VEGF治疗后可出现新生血管不成熟、组织水肿、血管渗漏等副作用，而FGF治疗则会发生蛋白尿等副作用。因此人们在寻求能促进多基因表达的因子，以诱导生理功能完整的血管新生。缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）进入了人们的研究视线。 HIF-1是缺氧病理生理发展过程中占有主要调节地位的转录因子，同时发现其对血管新生有很强的调节作用，其转录活性和蛋白表达水平受氧浓度调节。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成，HIF-1α为其氧依赖的主要调节单位。HIF-1α包括两个主要结构，氧依赖降解区(oxygen dependent degradation domain，

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 总体实验线路图
• 前言
• 第1章 腺病毒载体构建与鉴定
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 材料仪器
• 1.1.3 常用液体配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 感受态大肠杆菌DH5α的制备
• +-HIF-1α-Ala564-Ala803构建'>1.2.2 重组pcDNA3.1⁺-HIF-1α-Ala564-Ala803构建
• 1.2.3 重组pEGFP-C1-HIF-1α-Ala564-Ala803构建
• 1.2.4 重组pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803构建
• 1.2.5 重组腺病毒质粒
• 1.2.6 腺病毒的包装
• 1.3 结果
• +-HIF-1α-Ala564-Ala803'>1.3.1 构建pcDNA3.1⁺-HIF-1α-Ala564-Ala803
• 1.3.2 构建pEGFP-C1-HIF-1α-Ala564-Ala803
• 1.3.3 构建pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803
• 1.3.4 构建pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803
• 1.3.5 pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803和pAdeno-LacZ转染效率
• 1.3.6 pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803和pAdeno-LacZ转染HEK293A细 胞后细胞病变现象（Cytopathic-effect,CPE）
• 1.3.7 Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803和Adeno-LacZ病毒的鉴定和扩增
• 1.4 讨论
• 1.5 本章小结
• 第2章 HIF-1α诱变体促人脐静脉内皮细胞增殖的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 材料仪器
• 2.1.3 常用液体配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 TCID50法病毒滴度测定
• 2.2.2 病毒最佳感染率测定
• 2.2.3 HIF-1α及其诱变体基因的转录活性的测定
• 2.2.4 HIF-1α及其诱变体基因感染HUVEC后MTT的测定
• 2.2.5 Bradford法蛋白浓度测定
• 2.2.6 逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）
• 2.3 结果
• 2.3.1 病毒滴度测定
• 2.3.2 病毒适宜感染率的筛选
• 2.3.3 HIF-1α及诱变体转录活性的测定
• 2.3.4 HIF-1α基因及其诱变体的感染HUVEC后的MTT结果
• 2.3.5 HIF-1α基因及其下游靶基因VEGF的RNA水平变化
• 2.3.6 HIF-1α及其诱变体蛋白水平的变化
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 HIF-1α导入HUVEC后基因表达谱改变及其信号通路的初步探讨
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 材料仪器
• 3.1.3 常用液体配制
• 3.1.4 引物序列
• 3.2 方法
• 3.2.1 HIF-1α及其诱变体基因转染后核酸水平的检测
• 3.2.2 HUVEC核酸样品的制备
• 3.2.3 芯片的制备、杂交、洗脱、染色及检测
• 3.2.4 芯片扫描数据的处理：
• 3.2.5 Real-time PCR
• 3.2.6 Real-time PCR结果的数据处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 HIF-1α及其诱变体基因转染后核酸水平
• 3.3.2 RNA电泳图
• 3.3.3 基因芯片检测结果
• 3.3.4 基因芯片各组间的散点图
• 3.3.5 基因芯片各组间的差异基因
• 3.3.6 Real-Time PCR验证基因芯片的结果
• 3.4 基因芯片的生物信息学探讨
• 3.4.1 Gene Ontology分析
• 3.4.2 PANTHER分析
• 3.4.3 Genomatix分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 对于Angiogenesis通路
• 3.5.2 对于Apoptosis信号通路
• 3.5.3 对于VEGF信号通路
• 3.6 本章小结
• 全文小结
• 本研究不足之处
• 参考文献
• 附录
• 附图
• 图1 HIF1参与的生物学功能及直接调节的下游基因
• 图2 HIF-1参与调节的部分已知基因
• 图3 腺病毒包装流程图
• +质粒图谱及其多克隆位点'>图4 pcDNA3.1⁺质粒图谱及其多克隆位点
• 图5 pShuttle2质粒图谱及其多克隆位点
• 图6 pAdeno-X Viral DNA结构示意图及酶切位点
• 图7 pGL3-control Vector质粒图谱及酶切位点
• 图8 pGL3-Promoter Vector质粒图谱及酶切位点
• 图9 pEGFP-C1质粒图谱及酶切位点
• 学习期间发表论文
• 致谢
• 学位论文版权使用授权书