碳酸盐逆境下虎尾草叶片蛋白质组学研究

论文摘要

土壤盐渍化已经成为制约世界农业发展的重要因素。如何提高作物耐盐性、有效利用盐碱土资源已经成为亟待解决的重大课题。当前，关于植物耐盐性的研究主要集中于植物生态学和生理生化特性，以及利用分子生物技术和基因工程手段研究与植物耐盐性有关的基因，提高非盐生植物的耐盐性等方面，对盐生植物的开发研究和利用相对较少。与氯化钠盐逆境相比，对于以碳酸钠和碳酸氢钠为主的、对植物伤害更加严重的碳酸盐逆境研究十分薄弱，尤其是在分子生物学方面，关于碳酸盐逆境下植物蛋白质组的研究尚为空白。本研究利用耐盐碱的一年生禾本科C4植物虎尾草为材料，以中度耐盐的粳稻品种日本晴为参照，研究了碳酸盐（Na2CO3、NaHCO3）逆境下虎尾草的生长特性，分析了基质培养的虎尾草在碳酸钠胁迫下叶片蛋白质双向电泳图谱变化。在此基础上研究了碳酸氢钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质组，并根据质谱鉴定结果选择7个新的盐胁迫应答蛋白与一个已知盐胁迫应答蛋白GAPDH基因进行了转录表达水平研究。取得的主要结果如下：关于碳酸盐逆境下虎尾草的生长特性，在Na2CO3、NaHCO3、NaCl 3种盐胁迫下，随着盐浓度提高，两种植物的发芽率都降低。[Na+]相同的条件下，虎尾草和水稻的发芽率均为：NaCl＞NaHCO3＞Na2CO3。三种盐胁迫对两种植物发芽率的影响为：Na2CO3＞NaHCO3＞NaCl。两种植物相比，虎尾草种子对盐胁迫抗性高于水稻种子。三种盐胁迫下，虎尾草幼苗根长与芽长随盐浓度提高而下降；[Na+]相同条件下，三种盐胁迫对虎尾草根和芽的影响均为：Na2CO3＞NaHCO3＞NaCl。根和芽相比，三种盐胁迫对根和芽的影响均为：根＞芽。随NaHCO3胁迫浓度提高，水稻幼苗根与芽的干物重明显降低；随80mmol／L NaHCO3胁迫时间的延长，水稻幼苗根与芽的干物重也明显降低；而虎尾草幼苗的根和芽干物重变化则相对平缓。作为盐生植物，虎尾草幼苗对NaHCO3的抗性高于水稻。对基质培养条件下不同浓度碳酸钠胁迫的虎尾草叶片可溶性蛋白进行SDS-PAGE分析，结果50mmol／L Na2CO3胁迫24h后电泳条带最丰富，有4个蛋白条带由盐胁迫诱导或因盐胁迫而丰度增加，由此确定此时的虎尾草叶片全蛋白组成也必然发生很大变化。对50mmol／L Na2CO3胁迫24h后的虎尾草进行叶片蛋白质双向电泳，利用Image Master Elite 3.01双向电泳凝胶分析软件分析，得到42个与对照差异显著的蛋白质点，分布在pI3.63-9.60、Mw 17.12-69.19kDa的范围内。对于这些蛋白质与虎尾草对碳酸盐耐性的关系还有待于质谱鉴定和进一步的功能验证。水培条件下用80mmol／L NaHCO3处理3天是虎尾草抗性反应的临界条件，可以作为虎尾草生理生化、分子生物学研究中材料处理的一个适宜条件。对80mmol／L NaHCO3胁迫24h、48h和72h后的虎尾草叶片进行蛋白质组分析，结果表明，在CBB-R250染色后的双向电泳凝胶上，约有500个可重复、稳定出现的蛋白质点，其中的56个与碳酸氢钠胁迫有显著的应答关系。对其中的30个丰度相对较大的蛋白质点进行质谱鉴定，结合MALDI-TOF MS与MS／MS分析，鉴定得到23个蛋白质（多肽）。按生物功能分类，这些蛋白共分为6类。有9个与光合作用有关，约占39％，这说明作为C4植物，光合作用的调节可能在虎尾草碳酸盐抗性机制中发挥重要的作用；5个与碳代谢或氮代谢有关，维持碳氮代谢的稳定性可能对虎尾草的耐盐碱性具有重要的作用；此外，还有1个金属蛋白酶FtsH-like蛋白Pftf前体、3个转录因子、3个功能未知蛋白和2个其它蛋白也可能与虎尾草的碳酸盐耐性有重要关系。在已鉴定的23个蛋白中，RubisCO大亚基、GAPDH、UGPase等是已报道的、与植物耐盐性有关的蛋白；PSII OEC、ASP、FtsH-like蛋白Pftf前体、5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸盐-高半胱氨酸-S-甲基转移酶、PPR、转录起始因子IIF，α-亚基家族蛋白等与低温、高温、臭氧胁迫、氧化逆境、重金属毒害、生物侵染、高光等逆境应答有关，与盐逆境应答关系尚未见报道；PEPCK、类甲基化CpG结合蛋白、预测的OJ1767D02.15-2基因产物、3个功能未知蛋白等为新的与盐胁迫（或包括其它逆境）有关的蛋白，这些蛋白丰富了植物耐盐性研究的基因资源。选取质谱鉴定得到的7个新的盐胁迫应答蛋白以及前人已报道的盐胁迫应答蛋白GAPDH，以虎尾草cDNA为模板，根据8个蛋白的质谱鉴定的氨基酸序列以及Genbank中登录的基因序列的ORFs，利用软件分别设计合成了同源引物，进行基因片段的合成和探针的合成与标记，并用Northern blot分析了这些基因在盐胁迫下虎尾草叶片中的转录表达特性。5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸盐-高半胱氨酸-S-甲基转移酶基因、两个PEPCK基因、天冬氨酸氨基转移酶基因、GAPDH基因、PSII OEC蛋白1前体基因、转录起始因子IIF,a-亚基家族蛋白基因在mRNA水平表达变化与蛋白质水平变化趋势基本一致，都随着盐胁迫而增加。推定的FtsH-like蛋白Pftf前体基因的转录表达变化也与其蛋白质水平的变化趋势相同，都是随着盐胁迫而降低。逆境胁迫下植物基因的转录表达涉及诸多复杂的机制，关于碳酸盐胁迫下虎尾草盐胁迫应答基因的表达以及虎尾草的耐盐性机理还需要进行深入的探讨。本研究鉴定得到的蛋白仅是碳酸盐胁迫下虎尾草叶片蛋白质组的一小部分，其余蛋白还有待质谱鉴定。同时，已鉴定的蛋白也需要进一步的耐盐性功能解析。本文是第一个关于碳酸盐逆境下盐生植物蛋白质组的研究，对于虎尾草及其它盐生植物的耐盐碱机理、提高非盐生植物耐盐性，拓宽植物耐盐性研究视野提供了一种借鉴，并为盐生植物的开发和利用提供了一种新的尝试。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 碳酸盐逆境概述
• 1.2 植物耐盐性研究进展
• 1.2.1 植物耐盐性生态学研究进展
• 1.2.2 植物耐盐性生理生化研究进展
• 1.2.3 植物耐盐性分子生物学研究进展
• 1.3 蛋白质组学及其在植物耐盐性中的应用
• 1.3.1 蛋白质组学研究中的技术与方法
• 1.3.2 蛋白质组学在植物耐盐性研究中的应用
• 1.4 虎尾草概述
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 碳酸盐胁迫下虎尾草生长特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同盐胁迫对虎尾草与水稻发芽率的影响
• 2.2.2 不同盐胁迫对虎尾草幼苗生长的影响
• 2.2.3 碳酸氢钠浓度对虎尾草与水稻幼苗干物质积累的影响
• 2.2.4 碳酸氢钠胁迫时间对虎尾草与水稻幼苗干物质积累的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 不同盐逆境下虎尾草种子萌发特点
• 2.3.2 不同盐逆境下虎尾草幼苗生长特点
• 2.3.3 碳酸氢钠胁迫下虎尾草幼苗干物质积累特点
• 2.3.4 水培条件下虎尾草盐胁迫浓度的设置与优化
• 2.4 本章小结
• 3 碳酸钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质双向电泳研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 碳酸钠胁迫下虎尾草叶片可溶性蛋白质图谱分析
• 3.2.2 碳酸钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质双向电泳分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 虎尾草基质培养体系的确立
• 3.3.2 基质培养条件下虎尾草碳酸钠胁迫浓度的确定
• 3.3.3 虎尾草叶片双向电泳条件的优化
• 3.3.4 碳酸钠胁迫下虎尾草叶片双向电泳分析
• 3.4 本章小结
• 4 碳酸氢钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质组研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 碳酸氢钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质图谱分析
• 4.2.2 碳酸氢钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质的质谱鉴定
• 4.2.3 碳酸氢钠胁迫下虎尾草叶片蛋白质（多肽）的分类
• 4.3 讨论
• 4.3.1 碳酸氢钠胁迫下虎尾草叶片差异蛋白质的质谱鉴定
• 4.3.2 碳酸盐逆境应答蛋白的鉴定与功能分析
• 4.4 本章小结
• 5 虎尾草盐逆境应答蛋白基因的表达特性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 基因的检测探针的标记合成
• 5.2.2 盐逆境下不同蛋白基因的mRNA表达
• 5.3 讨论
• 5.3.1 盐逆境的设置
• 5.3.2 盐胁迫应答蛋白基因的转录表达特性及功能分析
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 I 缩略词汇表
• 附录 II 蛋白点质谱分析图谱
• 附录 III 蛋白质双向电泳图片
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢