大黄鱼Toll样受体免疫信号传导通路相关基因克隆与表达

论文摘要

大黄鱼（Pseudosciaena crocea）是我国特有的经济鱼种,以其味道鲜美,营养丰富和极高的药用价值而受到青睐。人工养殖迅猛发展,养殖规模的不断扩大和养殖环境日益恶化,导致病害频发,由此造成的经济损失也十分严重。因此,加强对大黄鱼免疫学理论的基础研究,了解其抗病免疫机制,对于大黄鱼病害防治十分重要。Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）通过识别病原体结构中保守的病原分子模式（PAMP）构成了机体抗感染的第一道防线。TLRs通过对病原识别后,与下游的接头因子MyD88、TRAF6结合,激活下游的炎症效应因子杀灭病原体。TLRs信号传导途径以反应快、作用广,在抵抗病原体的侵袭中发挥更重要的作用,并对获得性免疫的发生和类型起重要的调节作用。本研究利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼TLR9、MyD88、TRAF6基因全长cDNA序列,研究了它们在大黄鱼不同组织的表达谱。病原菌溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）免疫刺激后,采用Real-Time PCR分析了免疫刺激不同时间后大黄鱼脾脏、血液及肝脏中TLR9, MyD88, TRAF6在转录水平上的表达变化。结果表明：（1）大黄鱼TLR9基因分为A和B两种类型。TLR9A cDNA全长3637 bp,编码区3171 bp可编码1056个氨基酸,预测分子量121.385 kDa; TLR9B cDNA 3756 bp,编码区3021 bp可编码1006个氨基酸,预测分子量115.247 kDa。TLR9A与TLR9B存在LRR及TIR功能结构域,TIR结构域高度保守。TLR9A型TIR结构域包含3个保守的Box,与TLR9A相比TLR9B的TIR功能结构域区域较短,缺少保守的Box3。（2）MyD88基因cDNA全长1574 bp,编码区864 bp编码287个氨基酸的蛋白前体,预测分子量为33.075 kDa。（3）TRAF6 cDNA全长2013 bp,编码区1725 bp,可编码574个氨基酸的蛋白前体,预测分子量为64.727 kDa。（4）对上述基因的组织表达谱的结果表明,TLR9A、TLR9B、MyD88、TRAF6作为同一信号传导通路的基因,广泛存在于大黄鱼的大部分组织,并且表现出相似的表达特征：其中,脾脏中表达量最高,肌肉中表达量最低。溶藻弧菌诱导后,大黄鱼脾脏、肝脏、血液中TLR9A、TLR9B和MyD88基因表达量变化显著；血液中TRAF6基因表达量变化显著,而脾脏和肝脏中TRAF6基因表达量变化未达到显著水平。提示TLRs信号传导途径在大黄鱼的免疫反应中具有重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 大黄鱼概况
• 1.1.1 大黄鱼形态特征及营养价值
• 1.1.2 大黄鱼养殖业状况与发展
• 1.2 鱼类免疫系统
• 1.2.1 免疫组织
• 1.2.2 细胞免疫（cellular immunity）
• 1.2.3 体液免疫因子
• 1.2.4 鱼类的免疫应答
• 1.3 Toll样受体信号通路研究进展
• 1.3.1 TLRs家族、组织分布和结构特征
• 1.3.2 TLRs所识别的配体
• 1.3.3 TLRs的信号转导途径
• 1.3.4 TLRs介导的免疫调节功能
• 1.3.5 TLRs在鱼类养殖中的应用现状
• 1.4 研究目的和意义
• 第2章 大黄鱼Toll样受体9信号通路免疫相关基因克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA提取结果
• 2.2.2 大黄鱼TLR9基因全长cDNA序列结果
• 2.2.3 大黄鱼MyD88基因全长cDNA序列结果
• 2.2.4 大黄鱼TRAF6基因全长cDNA序列结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 大黄鱼TLR9基因
• 2.3.2 大黄鱼MyD88基因
• 2.3.3 大黄鱼TRAF6基因
• 第3章 弧菌刺激前后Toll样受体9信号通路免疫相关基因表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 RT-PCR扩增大黄鱼肌动蛋白检测反转录合成cDNA第一条链
• 3.2.2 Real-time PCR所用引物的RT-PCR检测结果
• 3.2.3 测序结果
• 3.2.4 熔解曲线分析
• 3.2.5 大黄鱼TLR9信号通路免疫相关基因的组织表达分析
• 3.2.6 弧菌对大黄鱼TLR9信号通路免疫相关基因的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 RT-PCR与Real-time PCR扩增曲线与溶解曲线分析
• 3.3.2 RT-PCR与Real-time PCR在基因定量方面的比较
• 3.3.3 弧菌刺激前后大黄鱼TLR9基因转录水平变化
• 3.3.4 弧菌刺激前后大黄鱼MyD88基因转录水平变化
• 3.3.5 弧菌刺激前后大黄鱼TRAF6基因转录水平变化
• 结论
• 参考文献
• 致谢