雷帕霉素脂质体滴眼液对大鼠角膜新生血管抑制作用的实验研究

论文摘要

目的：制备雷帕霉素（RAPA）脂质体滴眼液，建立大鼠角膜碱烧伤动物模型，研究RAPA对大鼠角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的抑制作用及它对HIF-1α及VEGF表达的影响，探讨RAPA抑制角膜新生血管的机理，并为通过抑制HIF-1α阻断VEGF信号传导通路抑制角膜新生血管提供理论依据。方法：利用薄膜分散法制备RAPA脂质体滴眼液，以正交设计法研究制备工艺中影响脂质体制备质量的主要影响因素，筛选出较理想的处方。将42只健康Wistar大鼠随机分为四组：A组正常对照组6只。B组碱烧伤空白对照组12只。C组碱烧伤空白脂质体对照组12只。D组碱烧伤RAPA脂质体治疗组12只。制备大鼠角膜碱烧伤动物模型，碱烧伤后：D组RAPA脂质体滴眼液滴眼，每天三次。C组空白脂质体滴眼液滴眼，每天三次。B组不予处理。另外各组氯霉素滴眼液预防感染，每天四次：每日裂隙灯观察眼局部情况，并详细记录碱烧伤后大鼠角膜反应情况及新生血管生长情况，并于碱烧伤后4d、7d、14d分别测量B、C、D三组角膜新生血管生长长度，计算生长面积。分别于碱烧伤后1d、4d、7d、14d随机抽取各组大鼠取材。免疫组织化学方法检测HIF-1α及VEGF蛋白的表达，计算机图象分析，测定阳性细胞的光密度值；半定量逆转录聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测角膜组织HIF-1αmRNA及VEGF mRNA的表达，数字凝胶图象分析系统测定各条带光密度值（IDV），以GAPDH为内参照，以HIF-1α及VEGF分别与GAPDH的IDV比值作为HIF-1α及VEGF表达水平的参数。结果：1．制得的RAPA脂质体，为完整的类球形，平均粒径为145.2nm，包封率为90.02％，RAPA脂质体滴眼液中RAPA含量高，粒径合适，可作为滴眼液用于动物实验。2．碱烧伤后1d时仅见损伤区角膜上皮水肿，角巩膜缘周围充血水肿；碱烧伤后4d可见角巩膜缘处有角膜新生血管芽呈毛刷状向角膜中央生长。第7d时，CNV显著变长，面积增加。14d时新生血管交织呈网状，基本布满整个角膜。3．RAPA治疗组与空白对照组及空白脂质体对照组相比CNV生长迟缓，稀疏，退化较早。CNV面积比较差异有显著性（P＜0.01）。两空白对照组之间面积比较差异无显著性（P＞0.05）。4．正常大鼠角膜上皮细胞有微弱的HIF-1α蛋白、VEGF蛋白的表达；碱烧伤后角膜上皮细胞、内皮细胞、炎症细胞，新形成的血管内皮细胞，HIF-1α蛋白及VEGF蛋白表达均明显增强，4d时表达最强，7d时开始下降，14d已降至正常。RAPA治疗组HIF-1α、VEGF的表达被显著抑制，与空白对照组及空白脂质体对照组相比差异有显著性（P＜0.01）。5．正常大鼠角膜有少量VEGFmRNA的表达，碱烧伤后表达增强，4d时表达最强，7d时开始下降，14d已降至正常。HIF-1αmRNA在正常角膜基本不表达，碱烧伤后有所增强，1d及4d时表达均高于正常，7d时已降至正常。RAPA治疗组HIF-1αmRNA、VEGFmRNAF的表达被显著抑制，与空白对照组及空白脂质体对照组相比差异有显著性（P＜0.01）。结论：1．脂质体是RAPA良好的药物载体。2．RAPA能显著抑制CNV的生长。3．碱烧伤以后HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、HIF-1α蛋白、VEGF蛋白表达显著增加。4．RAPA能显著抑制HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、HIF-1α蛋白、VEGF蛋白表达，可能是通过抑制HIF-1α的表达及活性，通过对转录的调控减弱VEGFmRNA及VEGF蛋白的表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 RAPA脂质体的制作
• 一 仪器和材料
• （一） 仪器
• （二） 实验材料
• 二 方法和结果
• （一） RAPA脂质体的制备
• （二） 含量分析方法的建立
• （三） 精密度试验
• （四） 回收率实验
• （五） 脂质体包封率的测定方法
• （六） 质量评价
• 三 结果
• 四 讨论
• （一） 脂质体药物载体
• （二） RAPA
• 五 结论
• 第二部分 RAPA滴眼液对大鼠角膜碱烧伤后形成的新生血管的作用
• 一 材料与方法
• （一） 实验材料
• （二） 实验方法
• 二 结果
• （一） 裂隙灯观察结果（CNV生长情况）
• （二） HE染色结果
• （三） 免疫组化染色结果
• （四） RT-PCR结果
• 三 讨论
• （一） 角膜新生血管（CNV）形成机制
• （二） HIF-1、VEGF与CNV的关系
• （三） RAPA与CNV的关系
• 四 结论
• 附图
• 综述
• 致谢