FoxO1调控骨骼肌纤维类型及其转型机制的研究

论文摘要

骨骼肌由异源特异性分化的肌纤维组成,不同类型的肌纤维在形态、代谢和收缩特性等方面存在较大差异。根据不同肌纤维中表达的特有肌球蛋白重链（MyHC）亚型,可将成年动物骨骼肌纤维类型分为4类:I型（慢收缩氧化型）,IIa型（快收缩氧化型）,IIx/d型（快收缩氧化酵解型）和IIb型（快收缩酵解型）。成熟骨骼肌保持高度可塑性,运动训练,环境影响和病理刺激等因素均能改变原有的肌纤维组成。叉头转录因子（FoxO1）是控制肌肉生长、代谢和细胞分化的重要转录因子,并有研究表明FoxO1参与调控骨骼肌纤维类型的转变。然而,FoxO1在骨骼肌纤维转型中的作用还不甚清楚。因此,本研究构建了稳定表达FoxO1的C2C12成肌细胞系,采用小鼠游泳耐力训练模型,免疫荧光,实时定量PCR,Western blotting和磷酸化酶活性测定等方法探索FoxO1在肌纤维类型生成和转变中的作用及可能的调控机制,主要研究结果如下:1、游泳耐力训练促使快酵解型纤维向慢氧化型纤维的转型。实时荧光定量PCR结果显示,对照组小鼠中慢氧化型肌肉比目鱼肌由60% I型和40% IIa型纤维组成,而快酵解型腓肠肌主要由IIb和IIx/d这两种快型纤维组成（总和>90%）。经历了四周游泳耐力训练的小鼠与对照组小鼠相比,比目鱼肌中MyHC I表达下降并伴随有MyHC IIa表达量的增加;腓肠肌中MyHC IIa和IIx表达上升而MyHC IIb减少（P<0.05）,MyHC I表达也有上升趋势,但变化不明显。2、游泳耐力训练后FoxO1活性降低。实时定量PCR结果表明,FoxO1基因表达量与肌纤维类型显著相关并在快肌中高表达（P<0.05）。FoxO1蛋白与基因表达一致,在腓肠肌中的含量是比目鱼中3-4倍（P<0.05）。与对照组相比,小鼠经耐力训练之后,FoxO1在两种肌肉中的表达总量都减少。Western blotting并没有检测到FoxO1总蛋白在这两种类型肌肉中的表达发生改变。然而,游泳锻炼能够促使FoxO1丝氨酸256位点的磷酸化水平上升,即增加了FoxO1的非活性形式。3、FoxO1抑制C2C12成肌细胞的终末分化。首先我们构建了稳定表达野生型FoxO1和突变型FoxO1（一种FoxO1持续活化的形式）的C2C12小鼠成肌细胞系,检测了成肌分化过程中早期（MyoD）,中期（myogenin）和晚期（MyHC）标志基因的持续表达情况。结果表明,对照组细胞中MyoD在成肌细胞早期表达,分化中期（D1）达到峰值,分化末期（D3）表达量回到基础水平。成肌分化中期标志myogenin早期表达量较低,中期达到峰值,末期表达量有所减少。晚期标志MyHC随着分化时间的推迟,表达量逐渐升高,到分化末期表达量达到最大。转染了FoxO1的成肌细胞与对照组细胞相比,分化第3天MyoD表达有少量的降低但myogenin蛋白量下调了约40%,而且终末分化时间也有所推迟。4、FoxO1诱导慢型纤维向快型纤维的转型。在正常分化的C2C12肌管中,MyHC IIx表达量最高,然后依次是MyHC IIb,MyHCⅠ和MyHC IIa。当转染了FoxO1后,MyHC IIx表达量上调并伴随有MyHCⅠ,MyHC IIa和MyHC IIb表达的减少。Western blotting结果显示,FoxO1促进快型MyHC蛋白但是抑制慢型MyHC蛋白的表达,这与转录水平的检测结果保持一致。值得注意的是,MyHC的总蛋白表达量也受到抑制。5、FoxO1遏制C2C12肌纤维的氧化代谢能力。我们利用抑制内源FoxO1活性的因子白藜芦醇（100μM）处理成肌细胞,结果发现,白藜芦醇可以增加氧化型纤维相关基因TnI slow和myoglobin的表达,却不足以改变肌纤维的组成比例。高表达FoxO1可以逆转白藜芦醇诱导的TnI slow和myoglobin表达的增加,并且白藜芦醇处理也能够拮抗过表达FoxO1引起的慢型纤维向快型纤维的转变。6、FoxO1抑制钙调神经磷酸酶的酶活性。高表达FoxO1的细胞株中,内源性钙调神经磷酸酶的酶活性受到显著抑制。进一步研究发现,钙调神经磷酸酶信号通路的下游靶基因钙调神经磷酸酶调节子互作蛋白外显子4（MCIP1.4）基因表达量也显著下调。白藜芦醇处理后,细胞中钙调神经磷酸酶活性没有变化。然而,实时定量PCR结果发现白藜芦醇可以显著增加MCIP1.4的表达量,并且可以抵消FoxO1对MCIP1.4的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 骨骼肌纤维类型的转型
• 1.1 骨骼肌的发育
• 1.2 骨骼肌纤维类型转型的信号通路
• 1.2.1 骨骼肌纤维的分类
• 1.2.2 不同类型骨骼肌纤维的特性
• 1.2.3 骨骼肌纤维类型转型的信号通路
• 第二章 FoxO1 调控骨骼肌纤维类型的转型
• 2.1 FoxO 的生物学功能
• 2.1.1 FoxO 结构特点
• 2.1.2 FoxO 蛋白通过磷脂酰肌醇-3-激酶信号途径的调节机制
• 2.1.3 FoxO 的作用模式
• 2.1.4 FoxO 蛋白的生理学作用
• 2.2 FoxO1 在肌纤维类型转型中的作用
• 2.2.1 FoxO1 调控肌纤维类型的转型
• 2.2.2 FoxO1 与CaN 信号通路之间的相互作用
• 实验研究
• 第三章 小鼠游泳运动训练后骨骼肌纤维类型的转变及FoxO1 表达变化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 慢肌比目鱼肌游泳运动训练后肌纤维类型组成的变化
• 3.2.2 快肌腓肠肌游泳运动训练后肌纤维类型组成的变化
• 3.2.3 游泳运动训练后FoxO1 基因表达变化
• 3.2.4 游泳运动训练后FoxO1 蛋白表达变化
• 3.3 讨论
• 第四章 高表达FoxO1 抑制骨骼肌细胞的分化
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 C2C12 小鼠成肌细胞系的培养及分化诱导
• 4.2.2 转染
• 4.2.3 免疫荧光
• 4.2.4 实时定量PCR
• 4.2.5 Western blotting 检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 C2C12 成肌细胞分化形成肌管
• 4.3.2 FoxO1 质粒成功转染C2C12 成肌细胞的鉴定
• 4.3.3 FoxO1 高表达对C2C12 成肌细胞分化的影响
• 4.3.4 FoxO1 高表达对成肌细胞分化标志基因的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 FoxO1 调控骨骼肌纤维类型的转型
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 C2C12 小鼠成肌细胞系的培养及分化诱导
• 5.2.2 转染
• 5.2.3 实时定量PCR
• 5.2.4 Western blotting 检测
• 5.2.5 引物序列
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 FoxO1 高表达和抑制剂处理C2C12 成肌细胞对靶基因的影响
• 5.3.2 FoxO1 对肌纤维类型特异MyHCs 基因生成的影响
• 5.3.3 高表达FoxO1 对肌纤维类型特异MyHCs 蛋白表达的影响
• 5.3.4 抑制FoxO1 对肌纤维类型特异MyHCs 蛋白表达的影响
• 5.3.5 FoxO1 对氧化型纤维标志基因的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 FoxO1 抑制钙调神经磷酸酶的酶活性
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 引物序列
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 实时荧光定量PCR
• 6.2.2 钙调神经磷酸酶活性检测
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 FoxO1 抑制钙调神经磷酸酶的酶活性
• 6.3.2 FoxO1 对钙调神经磷酸酶靶基因的影响
• 6.4 讨论
• 结论
• 创新点
• 进一步研究内容
• 参考文献
• 附录
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介