猪抵抗素和内脏脂肪素基因的克隆、表达与猪抵抗素多克隆抗体制备研究

论文摘要

抵抗素（resistin）和内脏脂肪素（visfatin）是最新发现的两个脂肪细胞因子,二者与肥胖、脂肪组织的形成以及代谢综合症的产生密切相关。本课题以长白猪为研究对象,克隆并优化表达了猪抵抗素和内脏脂肪素基因,制备了猪抵抗素多克隆抗体,构建了猪内脏脂肪素真核表达载体。本课题为研究抵抗素和内脏脂肪素对脂肪代谢作用机制以及瘦肉型猪的选择育种提供了相关资料,也可为进一步研究抵抗素和内脏脂肪素在代谢综合症中的作用机制以及代谢综合症类疾病治疗药物的研制提供参考。主要研究结果如下:1.序列克隆与分析:根据GenBank序列信息,应用RT-PCR,从长白猪肠系膜脂肪组织cDNA文库克隆出约360 bp抵抗素编码区序列和约1.5 kb内脏脂肪素编码区序列,并已提交美国国家生物信息中心（NCBI）GenBank数据库（EU707339）。序列分析发现,长白猪与梅山猪抵抗素编码区序列完全一致,而内脏脂肪素CDS区第47位和第115位存在碱基差异（分别为A-G和T-C转换）。2.猪抵抗素原核表达载体pGEX-KG-Rest构建与高效表达条件:根据已克隆的长白猪抵抗素序列,设计引物,PCR扩增成熟肽编码区、酶切、亚克隆至原核表达载体pGEX-KG,经宿主菌筛选后,进行培养基pH值以及诱导时间、IPTG（异丙基-β-D硫代半乳糖苷）诱导浓度、诱导温度等条件优化研究。pGEX-KG-Rest高效表达条件为:诱导最佳时间3h;IPTG最佳诱导浓度为0.3 mmol/L;30℃优于37℃诱导;Rosetta表达菌优于BL21表达菌;培养基pH6.5和pH7.8时表达量较高。3.兔抗猪抵抗素融合蛋白多克隆抗体制备:选取最佳表达菌株,制备猪抵抗素重组蛋白,包涵体提取和蛋白复性后,用弗氏佐剂混合免疫新西兰大耳兔,3次免疫后获得较高效价（1:16）兔抗猪抵抗素融合蛋白多克隆抗体。4.猪内脏脂肪素原核表达载体pGEX-KG-Vis构建与高效表达条件:根据已克隆内脏脂肪素基因序列信息,设计扩增全长CDS区引物。PCR扩增、酶切、亚克隆至原核表达载体pGEX-KG,经表达宿主菌株筛选后,进行表达诱导时间、诱导剂IPTG诱导浓度梯度研究和SDS-PAGE检测鉴定。pGEX-KG-Vis高效表达条件为:诱导最佳时间2 h,诱导最佳IPTG浓度0.1 mmol/L,Rosetta表达菌优于表达菌BL21。5.猪内脏脂肪素真核表达载体pcDNA3.1（+）-Vis构建:根据已克隆的内脏脂肪素基因序列和pcDNA3.1（+）载体信息,设计扩增全长CDS的引物,PCR扩增、酶切、亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。重组载体经鉴定达到预期要求。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.抵抗素简介与研究进展
• 1.1 抵抗素分子生物学特征
• 1.1.1 抵抗素分子特征与组织分布
• 1.1.2 抵抗素表达调控
• 1.1.3 抵抗素生物学活性特征
• 1.2 抵抗素作用机制
• 1.2.1 诱发胰岛素抵抗作用机制
• 1.2.2 参与炎症反应、内皮细胞功能障碍机制
• 1.2.3 抵抗素诱发脂代谢异常机制
• 1.3 抵抗素信号转导通路
• 1.3.1 诱发胰岛素抵抗信号转导途径
• 1.3.2 抵抗素调节脂代谢信号转导途径
• 1.3.3 抵抗素诱发内皮细胞功能障碍信号转导途径
• 1.4 抵抗素与相关疾病的研究进展
• 1.4.1 抵抗素与糖尿病
• 1.4.2 抵抗素与肥胖
• 1.4.3 抵抗素与心血管类疾病
• 1.4.4 抵抗素与炎症
• 1.4.5 抵抗素与其它疾病
• 1.5 猪抵抗素研究进展
• 2.内脏脂肪素简介与研究进展
• 2.1 Visfatin分子生物学特征
• 2.1.1 Visfatin分子特征与组织分布
• 2.1.2 Visfatin表达调控
• 2.1.3 Visfatin生物学活性特征
• 2.2 Visfatin调节表达与作用机制
• 2.2.1 Visfatin调节表达机制
• 2.2.2 Visfatin降血糖机制
• 2.2.3 NAMPT酶的作用机制
• 2.2.4 Visfatin促进脂肪分化机制
• 2.3 Visfatin信号转导通路
• 2.4 Visfatin与疾病相关研究进展
• 2.4.1 Visfatin与Ⅱ型糖尿病
• 2.4.2 Visfatin与肥胖
• 2.4.3 Visfatin与炎症反应
• 2.4.4 Visfatin与其它疾病
• 第二章 猪visfatin基因的克隆与表达研究
• 1 目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 组织样品
• 2.1.2 酶、Marker和试剂盒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 载体和菌株
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.1.7 引物设计
• 2.2 方法
• 2.2.1 猪肠系膜脂肪总RNA提取
• 2.2.2 RT-PCR合成猪肠系膜脂肪cDNA
• 2.2.3 猪visfatin基因编码区克隆
• 2.2.4 重组载体pGEX-KG-Vis和pcDNA3.1（+）-Vis构建
• 2.2.5 Visfatin融合蛋白诱导表达与表达株筛选
• 2.2.6 重组表达载体pGEX-KG-Vis表达研究
• 2.2.7 Visfatin融合蛋白SDS-PAGE分析
• 3 结果
• 3.1 猪肠系膜脂肪总RNA提取结果与分析
• 3.2 猪visfatin编码区克隆结果与分析
• 3.2.1 PCR扩增结果
• 3.2.2 T载体连接鉴定结果
• 3.2.3 测序鉴定结果
• 3.2.4 核酸序列和氨基酸序列分析结果
• 3.3 猪visfatin真核表达载体构建结果与分析
• 3.3.1 重组菌PCR筛选与初步鉴定
• 3.3.2 重组质粒酶切鉴定
• 3.3.3 重组质粒测序鉴定
• 3.4 猪visfatin原核表达载体构建结果与分析
• 3.4.1 重组质粒PCR鉴定
• 3.4.2 重组质粒酶切鉴定
• 3.4.3 重组质粒测序鉴定
• 3.5 猪visfatin原核表达与表达菌株筛选结果
• 3.6 猪visfatin原核表达条件优化结果与分析
• 3.6.1 IPTG诱导浓度优化结果
• 3.6.2 诱导时间优化结果
• 3.6.3 Visfatin重组载体pGEX-KG-Vis高效表达条件
• 4 讨论
• 4.1 关于猪visfatin基因的克隆
• 4.2 关于猪visfatin真核表达载体构建与原核表达
• 第三章 猪抵抗素基因克隆表达与多克隆抗体制备
• 1 目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要溶液配制
• 2.1.2 引物设计
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA提取与RT-PCR
• 2.2.2 猪抵抗素编码区克隆
• 2.2.3 重组载体pGEX-KG-Rest构建
• 2.2.4 抵抗素融合蛋白诱导表达与表达株筛选
• 2.2.5 重组表达载体pGEX-KG-Rest表达条件研究
• 2.2.6 猪抵抗素融合蛋白SDS-PAGE分析
• 2.2.7 猪抵抗素融合蛋白包涵体提取与纯化
• 2.2.8 猪抵抗素多克隆抗体制备
• 3 结果
• 3.1 猪肠系膜脂肪总RNA提取结果与分析
• 3.2 猪抵抗素编码区克隆结果与分析
• 3.2.1 PCR扩增结果
• 3.2.2 T载体连接鉴定结果
• 3.2.3 测序鉴定结果
• 3.2.4 核酸序列和氨基酸序列比对分析结果
• 3.3 猪抵抗素原核表达载体构建结果与分析
• 3.3.1 重组质粒PCR鉴定
• 3.3.2 重组质粒酶切鉴定
• 3.3.3 重组质粒测序鉴定
• 3.4 猪抵抗素原核表达与表达菌株筛选结果
• 3.5 猪抵抗素原核表达条件优化结果与分析
• 3.5.1 不同pH值培养基诱导表达优化结果
• 3.5.2 不同诱导温度优化结果
• 3.5.3 不同IPTG诱导浓度优化结果
• 3.5.4 不同诱导时间优化结果
• 3.5.5 猪抵抗素重组载体高效表达条件
• 3.6 猪抵抗素原核表达蛋白包涵体提取结果
• 3.7 兔抗猪抵抗素多克隆抗体制备结果
• 4 讨论
• 4.1 关于猪抵抗素基因克隆与表达条件
• 4.2 关于兔抗猪抵抗素多克隆抗体制备
• 参考文献
• 致谢