胎盘间充质干细胞对骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞的体外扩增支持作用比较

论文摘要

研究背景及目的间充质干细胞（mesenehymal stem cell,MSC）是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。Fridenestein等于1976年最早利用骨髓贴壁层细胞培养形成了成纤维细胞和其它间质细胞。随后其他学者也描述了来源于骨髓的非造血性贴壁细胞,可以分化为成熟的间质细胞。认为这种原始细胞可形成骨髓和外膜间质细胞,构成造血的微环境,形成结缔组织骨架并产生细胞因子、化学因子和细胞外基质蛋白来调节造血细胞的归巢和增殖。体外培养MSC分泌多种造血因子,并能表达多种表面粘附分子,在造血调控中具有一定的作用。因此,移植MSC使其恢复骨髓微环境,支持自体和同种异基因造血干细胞移植和重建,引起了很多研究者的关注。造血干/祖细胞（hematopoietie Stem/progenitor Cell,HSPC）的扩增和增殖,造血因子是必不可少的。Hyanesworht等培养了可向成骨细胞和成软骨细胞分化的原始间充质细胞,单克隆抗体检测其表达SH-2、SH-3和SH-4。在无造血细胞和分化刺激存在的培养条件下,可产生多种造血相关因子,包括干细胞因子（CSF）、白血病抑制因子（LIF）、巨嗜系集落刺激因子（M-CSF）、粒系集落刺激因子（G-CFS）、白细胞介素IL-6和IL-11。而粒单系集落刺激因子（MG-CSF）、IL-3、转化生长因子（TGF-β2）未被检测到。用具有能增强骨髓基质细胞支持造血能力的因子IL-Ia,刺激这种原始间充质细胞,可提高其G-CFS、M-CFS、LIF、IL-6和LI-11的产生水平,而且工IL-Ia还能诱导其产生GM-CSF。Majumdar等比较了骨髓来源的MCS和传统基质细胞,通过RT-PRC检测了造血相关因子mRNA的表达,结果表明MSC稳定的表达多种造血相关因子IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、-12、IL-14、IL-15、M-CSF、SCF和Flt-3配体（FL）,且IL-11、IL-12的表达水平明显高于基质细胞。两种细胞在IL-Ia诱导下均表达G-CFS和GM-CFS,但LIF和IL-Ia的mRNA则只在MSC中被诱导表达。目前对造血干细胞CD34+的体外扩增主要靠加入不同组合的细胞因子,体外加入的细胞因子很难模拟造血的微环境,且在培养过程中需要不断加入,价格昂贵,不适合长期培养。近来有研究者用骨髓基质支持骨髓来源的CD34+细胞,用胎盘来源的间充质干细胞支持脐血来源的CD34+细胞,也取得很好的效果,胎盘作为胎儿的附属物,在胎儿娩出后往往作为废弃物被处理,近年有研究者发现胎盘组织及胎盘血中存在造血干细胞,及间充质干细胞,并且研究证实胎盘间充质干细胞可分泌多种造血相关因子。因此我们从胎盘中分离出间充质干细胞,作为不同来源的CD34+的滋养层,观察其对不同来源造血干细胞的支持扩增作用的差别。材料:胎盘及脐血样品:正常健康新鲜的胎盘组织和脐血来自郑大一附院妇产科。骨髓样品正常新鲜的骨髓来自郑大一附院儿科磁性细胞分选仪及CD34+细胞分离盒为Miltenyi Biotec公司产品。细胞因子和抗体:B-fbf为Gibco公司产品。抗CD29、CD19、CD34、CD44、CD45、HLA-DR、HLA-ABC、CD105、CD106及UEA-Ⅰ单克隆抗体为PharMingen公司主要试剂:牛血清白蛋白BSA甲基纤维素、巯基乙醇、谷氨酰胺、氢化考的松、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、DNaseⅠ酶均购自Sigma公司。DMEM培养基、IMDM培养基,四季青胎牛血清均为Hyclone公司产品。方法1.胎盘间充质干细胞的分离培养及鉴定:将胶原酶消化后的胎盘组织细胞用100目的不锈钢网滤过,去除未消化组织,滤过后的悬液用无菌PBS液洗两遍,按5×106个/ml接种含20%FBS的DMEM培养基中,在37℃恒温箱,5%CO2和饱和湿度下培养。贴壁48-72小时后去除未贴壁细胞,继续培养,3-4天换液一次。待细胞80-90%融合后,用胰蛋白酶（0.25%）消化,传代培养。2.将传代3代以上的细胞用免疫组化方法确定其外形特点。分别取第6、9和12代细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化收获细胞,PBS洗涤计数后,分别与抗CD19,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105,CD106,HLA-DR,HLA-ABC,UEA-1单克隆抗体室温避光反应30分钟。PBS液冲洗后,用流式细胞仪检测其表面标志。3.不同来源血干细胞CD34+的提取:常规提取骨髓脐血及胎盘组织的单个核细胞,用免疫磁珠法分离出CD34+细胞。4.造血干细胞细胞扩增分组:试验分为A:无滋养层组B:有滋养层组。A组分为A1（骨髓组）A2组（脐血组）A3（胎盘组）;B组分为B1组（骨髓组）B2（脐血组）B3组（胎盘组）每组6复孔。将不同来源的造血干细胞分别置于上述培养基中,每周进行有核细胞计数,CD34+细胞比例流式检测,计算CD34+细胞的扩增倍数。5.统计学处理计数资料采用重复测量的方差分析,判定结果的差异性结果1.人胎盘中存在间充质干细胞。2.用胎盘间充质干细胞作为滋养层比无滋养层的培养体系对CD34+细胞有明显的扩增效应,以HPDMSCS作为以上三种来源的造血干细胞的滋养层,对胎盘来源的造血干细胞支持作用明显优于其他两组,扩增了（2.6±0.17）倍（8.7±1.2）倍（16.8±2.2）倍（11.6±1.8）倍,脐血次之;扩增了（2.0±0.2）倍（4.3±1.2）倍（11.2±2.4）倍（6.7±1.9）倍;对骨髓来源的造血干细胞最差,扩增了（1.8±0.3）倍（4.6±1.1）倍（8.7±1.4）倍（4.2±0.4）倍。结论1人胎盘中存在胎盘间充质干细胞。2.胎盘间充质干细胞可以作为骨髓,脐血,胎盘不同来源造血干细胞体外扩增的滋养层,尤其适于胎盘来源的造血干细胞。3.来源于胎盘造血干细胞生长最好,扩增倍数最高,脐血次之,骨髓最差。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 论文部分 胎盘间充质干细胞对骨髓,脐血,胎盘不同来源造血干细胞的体外扩增支持作用比较
• 引言
• 实验材料与方法
• 实验结果
• 附图表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述部分 胎盘间充质干细胞的研究进展及展望
• 正文
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢