含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的遗传转化及表达活性分析

论文摘要

植物抗病基因工程是植物抗病育种常用的工具之一,利用病原物诱导启动子驱动功能基因以提高植物的抗病性比组成型启动子有明显的优势。植物在环境中经常同时遭受不同病原物的为害,因而植物需要广谱的抗病性。由于单个启动子受诱导因子谱的限制,利用单一病原物诱导启动子驱动功能基因的表达,对入侵病原物的打击范围是有限的。本研究把两个具有高度病原物诱导特异性的启动子EAS4和hsr203J构建到同一个植物表达载体上,通过对烟草的遗传转化,分析转基因植株中启动子的诱导表达活性,说明串联两个启动子,可以增加诱导因子的范围,扩大转基因植物的抗病谱,这对于抵抗几种病原物的侵染尤其有重要意义。同时,出于对转基因安全性的考虑,利用两个T-DNA边界将目的基因与抗生素抗性基因分开,通过转基因植株的后代自交分离,获得了只含目标基因而不含抗生素标记的转基因植株。所得结果如下:1、构建了含双病原物诱导启动子的植物表达载体,并对烟草进行了遗传转化以pCAMBIA2301为基本构架,选用两个来自烟草的、具有高度病原物诱导特异性的启动子EAS4和hsr203J,替换驱动uidA（报告基因GUS）基因表达的CaMV 35S启动子。为了分析串联的两个启动子活性是否有位置效应,同时构建启动子串联次序不同的两种植物表达载体HP1+EP2（hsr203J+EAS4+uidA）和EP1+HP2（EAS4+hsr203J +uidA）,并分别以单启动子hsr203J和EAS4驱动uidA为对照,构建了四个表达载体。通过农杆菌介导的叶盘转化法将表达载体转化烟草。对200株抗生素抗性植株进行PCR筛选,共获得152株PCR阳性植株。2、转基因植株中启动子表现明显的诱导表达活性,双启动子比单一启动子表现更强的诱导表达活性为检测转基因植株中启动子的诱导表达活性,从RNA水平、GUS的定性、定量检测等方面,对不同病原物诱导的启动子活性进行了研究。2.1随机选取30株PCR检测呈阳性的植株,用激发子parasiticein处理后提取诱导部位组织的总RNA,经RT-PCR检测,发现24株（80%）获得了与GUS基因预期大小一致的特异性片段,表明这些转基因烟草中GUS基因经诱导后可在转录水平上表达。2.2选取14株RT-PCR呈现阳性的植株,分别用烟草黑胫病菌（ Phytophthora nicotianea [0] ）、烟草青枯病菌（ Ralstonia solanacearum）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）和激发子parasiticein等诱导处理,经组织化学染色发现,在检测的植株中,除单一启动子ESA4不受灰霉菌诱导外,经其它病原物处理的植株都不同程度地被染成蓝色,而清水处理的叶片几乎没有颜色变化或仅有很轻微的背景色,表明,本研究所构建4个表达载体中,启动子都具有病原物诱导表达的活性,并且,双启动子较单启动子表现出更为广泛的诱导谱。2.3为明确单、双启动子是否存在诱导表达量的差异,用荧光法对GUS基因的诱导表达活性进行了定量检测。结果发现,转基因植株经P. nicotianea[0]、R. solanacearum和激发子parasiticein诱导后6h,双启动子HP1+EP2的诱导表达活性比单启动子hsr203J高5.9-8.0倍,比EAS4高6.7-7.9倍;双启动子EP1+HP2比单启动子hsr203J的诱导表达活性高5.0-5.7倍,比EAS4高4.7-6.5倍,双启动子与单启动子的活性差异均达极显著水平。双启动子HP1+EP2和EP1+HP2的诱导表达活性也存在极显著差异,而两个单启动子HP1和EP1之间没有明显差别。2.4同时,用荧光法对GUS的诱导表达活性进行了动态检测,发现双启动子HP1+EP2的诱导表达高峰一般出现在诱导后6-10h,而双启动子EP1+HP2的活性高峰一般在诱导后8-14h。在检测的时间范围内,双启动子的诱导活性始终高于单一启动子。这些结果说明,本研究所构建的4个载体中,启动子都具有病原物诱导表达活性,都可被多种病原物诱导表达。双启动子不仅有更广泛的诱导表达谱,而且诱导表达活性显著高于单启动子。3、转基因株系在T1代可以实现NPTII基因与功能基因uidA的自由分离,获得不含抗生素标记的、安全的转基因后代抗生素标记是转基因植物安全性所关注的重要内容之一,出于对转基因植物安全性的考虑,在载体设计时引入了双边界序列,把卡那霉素抗性基因NPTII表达盒和uidA基因表达盒分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株后代的自交分离,筛选获得只含目的基因而不含NPTII的转基因植株。首先对14个转基因株系的T1代幼苗用含卡那霉素的平板进行了表型检测,结果发现,13个株系的NPTII基因的分离比平均为2.89:1,接近3:1,表明这13个株系中NPTII基因可能为单拷贝插入。为检测NPTII基因与uidA在T1代中是否发生自由分离,从13个NPTII单拷贝株系的T1代植株中随机选取130株,提取基因组DNA,PCR法对其NPTII基因和uidA基因同时进行扩增,结果是:只含uidA基因的植株占被扩增整体的20.77%,只含NPTII基因的占22.31%,同时含有NPTII基因和uidA基因的为53.85%,其分离比经X2检测符合两个相互独立的基因自由分离的比例9:3:3:1。说明转基因植株中NPTII基因与目标基因分别插入植物总DNA的不同部位,并在自交后代中发生自由分离。

论文目录

• 缩略词及中英文对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 抗病基因工程的原理及发展
• 1 抗病基因工程的原理
• 1.1 系统获得抗性
• 1.2 基因对基因学说
• 2 用于植物抗病基因工程的目的基因
• 2.1 植物的抗病基因
• 2.2 病原物的无毒基因
• 2.3 植物的防卫反应基因
• 3 抗病基因工程的发展
• 第二章 植物基因的表达与调控
• 1 基因结构的活化
• 2 转录水平调控
• 2.1 顺式作用元件
• 2.2 反式作用因子
• 2.3 转录复合物的形成
• 3 转录后水平调控
• 4 翻译及翻译后的调控
• 第三章 高等植物启动子的研究进展
• 1 高等植物启动子的结构
• 1.1 转录起始位点
• 1.2 TATA 框与Inr 元件
• 1.3 一般上游启动子元件
• 1.4 其他的上游元件
• 2 高等植物启动子的功能
• 3 高等植物启动子的分类
• 3.1 组成型启动子
• 3.2 特异型启动子
• 4 本研究的目的意义
• 第二部分 研究内容
• 第一章 植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 含双边界序列植物双价表达载体p2301NG 的构建
• 2.2 含病原物诱导启动子EA54 和hsr203 瞄物安全表达载体的构建
• 2.3 质粒的提取和单酶切鉴定
• 2.4 质粒载体对农杆菌的转化及阳性重组子鉴定
• 2.5 转基因植株的获得
• 2.6 转基因植株的PCR 检测
• 3 结论与讨论
• 第二章 转基因植株中启动子诱导表达活性检测
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因植株中GUS 基因的诱导转录
• 2.2 GUS 基因编码产物的活性分析
• 2.3 GUS 的定量检测
• 2.4 转基因植株中启动子诱导活性的时间动态
• 3 结论与讨论
• 第三章 转基因T1 代植株中NPTII 基因与功能基因uidA 的分离
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素浓度的筛选
• 2.2 转基因T1 代幼苗抗生素抗性的表型分化及其分子检测
• 2.3 转基因烟草中nPtII 基因与uidA 基因的分离
• 3 结论与讨论
• 总结与展望
• 一、全文总结
• 二、研究展望
• 参考文献
• 附录
• 1 GUS 定量检测的基本数据
• 1.1 水诱导转基因烟草6h 的GUS 定量检测的数据
• 1.2 激发子Parasiticein 诱导转基因烟草6h 的Gus 定量检测的数据
• 1.3 疫霉游动孢子诱导转基因烟草6h 的GUS 定量检测的数据
• 1.4 青枯细菌诱导转基因烟草6h 的GUS 定量检测的数据
• 1.5 Parasiticein 诱导叶片不同时间的GuS 活性变化
• 1.6 疫霉孢子诱导叶片不同时间的Gus 活性变化
• 1.7 烟草青枯菌诱导叶片不同时间的GUS 活性变化
• 2 转基因植株T1 代基因分离的PCR 检测结果
• 致谢