PSD-95小干扰RNA沉默效率评估与功能研究

论文摘要

前言:突触后致密物蛋白质95（PSD-95）参与调节的谷氨酸受体相关信号转导是神经病理性疼痛中枢敏化机制的重要环节。目的:评估小干扰RNA（siRNA）对PSD-95基因的沉默效率以及PSD-95基因沉默对谷氨酸诱导的神经细胞毒性与信号转导的影响。方法:将化学合成的大鼠PSD-95基因特异的siRNA转染小鼠神经母细胞瘤/大鼠神经胶质细胞瘤杂交瘤细胞（NG108-15细胞）,利用实时定量PCR评估转染试剂、转染方式、时间、细胞密度、siRNA剂量等对沉默效率的影响。利用谷氨酸刺激PSD-95基因沉默的NG108-15细胞,检测细胞生长活力与信号通路蛋白质表达与磷酸化的改变。结果:序列特异性最高的siRNA在最佳的转染条件下导致PSD-95基因表达水平下降91.5%;PSD-95基因沉默既增强了神经细胞对谷氨酸毒性耐受能力,又可抑制Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白质激酶Ⅱα异构型的磷酸化。结论:PSD-95-siRNA可能成为有效控制神经病理性疼痛的基因治疗方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 名词缩写
• 引言
• 一、突触后致密物、PSD-95及其相关突触后信号转导
• 二、神经病理性疼痛及siRNA介导的基因沉默
• 三、本研究的设计思路与研究路线研究
• 材料方法
• 材料
• 一、化学合成siRNA、shRNA质粒、细菌菌株、细胞株系与实验动物
• 二、引物设计与合成
• 三、主要试剂与试剂盒
• 四、主要实验仪器、设备与耗材
• 五、主要应用软件与网络服务器
• 方法
• 一、神经细胞的体外培养
• 二、siRNA与shRNA质粒的转染前准备
• 三、siRNA与shRNA质粒的体外转染
• 四、谷氨酸对NG108-15细胞的影响
• 五、神经细胞目的基因的表达与磷酸化水平检测
• 结果
• 一、PSD-95-siRNA基因序列分析与PSD-95-shRNA质粒构建
• 二、PSD-95-siRNA与pPSD95对神经细胞中PSD-95基因的沉默效果
• 三、PSD-95基因沉默对谷氨酸受体相关CaMKⅡα表达与磷酸化的影响
• 四、NG108-15细胞与胚胎大鼠皮层神经元NMDA受体表达差异
• 五、PSD-95-siRNA对胚胎大鼠皮层神经元PSD蛋白质表达的影响
• 讨论
• 一、PSD-95-siRNA沉默效率的影响因素及其优化条件
• 二、NMDA受体、PSD-95与CaMKⅡ影响神经细胞耐受病理性损伤的能力
• 三、PSD-95基因沉默对疼痛相关信号转导的影响
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述
• 个人简历