论文摘要
研究目的：理想的肿瘤治疗方法是使抗肿瘤药以一定的浓度和时间在肿瘤组织内充分发挥作用，同时减少药物的毒副作用。常规的全身性系统化疗往往无法在肿瘤组织中达到有效的药物浓度，而加大药物剂量势必会增加了一定的毒副作用，从而使机体不能耐受。因此为增强抗肿瘤药的作用，已有许多研究通过将抗肿瘤药注入实体肿瘤内，使肿瘤组织长时间与高浓度的抗肿瘤药接触，从而提高了治疗肿瘤的疗效。在此基础上，我们利用肿瘤组织作为药物载体形成药物缓释库，将有效的化疗药物结合缓释液及半抗原二硝基苯（DNP）进行肿瘤内的缓释治疗，通过提高药物在肿瘤部位的作用，加强对肿瘤细胞的杀伤能力以及刺激机体免疫应答，从而达到更加有效的治疗肿瘤的目的。研究方法：实验动物C57BL／6小鼠，雌雄各半，周龄6～8周，体重18～22g，无菌环境中饲养。B16黑色素瘤细胞用RPMI1640（含10％FCS）培养，37℃，5％CO2的恒温环境中培养，约2～4天传代。选取对数生长期的B16黑色素瘤细胞造模，此时细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳。将制备好的浓度为2×106个／ml瘤液取0.2ml于无菌条件下皮下注射接种于小鼠左前肢腋下，一般在接种后5～6天时肿瘤生长至符合实验要求，随机分组进行初次治疗，0.2ml／只，依次为①生理盐水对照组，瘤内注射NS；②Ara-C对照组，瘤内注射Ara-C；③单纯缓释治疗组，瘤内注射Ara-C+缓释液；④免疫缓释治疗组，瘤内注射Ara-C+缓释液+DNP。4天后进行重复治疗，观察各组小鼠肿瘤的生长情况。两次治疗1周后脱颈椎处死实验动物，无菌取肿瘤组织和脾脏进行后续实验。后续实验包括：（1）测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。（2）肿瘤标本HE染色和三种纤维（网状纤维、弹力纤维、胶原纤维）特殊染色标记。（3）肿瘤组织内免疫组织化学检测：CD4，CD8，ICAM-1。（4）流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞数量。研究结果：（1）瘤内缓释治疗对小鼠肿瘤生长的影响瘤内缓释治疗的抑瘤实验结果表明两组缓释治疗均对肿瘤的增长有明显的抑制作用，提示缓释治疗可以抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长。同时在缓释治疗的两组中，免疫缓释治疗组与单纯缓释治疗组相比，前者对肿瘤生长的抑制更加有效。由肿瘤生长曲线可看出各组的肿瘤生长曲线斜率都有明显的差别。随时间进展，生理盐水对照组肿瘤体积增长速度明显高于其他组别，而免疫缓释治疗组，肿瘤体积增长在第二次治疗后出现平台期，肿瘤增殖相对停滞。（2）瘤内缓释治疗后肿瘤组织的病理改变切片镜下可见，对照组瘤细胞排列密集成片，坏死区较少，瘤体内血管丰富，肿瘤组织生长旺盛。单纯缓释组及免疫缓释组的瘤细胞区域则出现大片坏死，瘤细胞溶解以及细胞核固缩，散在区域性存活肿瘤细胞灶，切片染色较对照组浅。肿瘤坏死情况：观察肿瘤坏死范围，并根据不同坏死程度所占比例计算坏死率，其坏死程度不一；生理盐水对照组坏死较少；Ara-C组以轻、中度坏死为主，部分见到小片状瘤细胞变性；缓释两组以中重度坏死为主，见到大小不一的多个凝固性坏死灶。（3）瘤内缓释治疗后肿瘤组织的三种纤维特殊染色切片特殊染色显示与两对照组相比，两治疗组的肿瘤组织中弹性纤维明显较粗，连续分布于肿瘤组织内及瘤旁组织，着色深；胶原纤维明显增多，排列紊乱，出现分支且互相交织，呈连续分布，着色深；瘤组织中网状纤维明显增多、增粗，有大的分支并交织成网状，着色深。定量分析显示与两对照组相比，单纯缓释治疗组和免疫缓释治疗组中三种纤维含量均明显升高（P＜0.01）。（4）瘤内缓释治疗后肿瘤组织的ICAM-1免疫组化染色染色阳性信号为棕黄色颗粒，主要是细胞膜表达。染色结果显示两缓释治疗组的肿瘤组织中ICAM-1阳性表达量明显较两对照组增多（P＜0.01）。在两治疗组中，免疫缓释组较单纯缓释组的ICAM-1阳性表达量同样也有明显的增多（P＜0.05）。（5）瘤内缓释治疗后肿瘤组织的CD4，CD8免疫组化染色染色阳性信号为棕黄色颗粒，主要是细胞膜表达。染色结果显示两治疗组的肿瘤组织中CD4，CD8阳性表达量明显较两对照组增多。（6）流式细胞术分析脾内T细胞数量FCM检测结果显示，与NS对照组和Ara-C对照组相比，两治疗组脾脏中CD4+及CD8+T淋巴细胞标记率均明显增高（P＜0.01）。但各实验组CD4+／CD8+的比值之间未有统计学意义（P＞0.05）。这个结果表明缓释治疗可在一定程度上改善细胞免疫功能。结论：1．瘤内缓释治疗可以明显抑制小鼠肿瘤生长，导致肿瘤细胞大片坏死。2．瘤内缓释治疗后可通过增加肿瘤部位细胞间黏附分子和纤维的生成来抑制肿瘤细胞的转移和扩散。3．缓释治疗还可通过增加瘤内局部浸润的CD4、CD8细胞数量以及外周CD4和CD8的细胞数量，增加细胞免疫功能。
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