论文摘要
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）世界各国流行,是养猪业危害最严重的疾病之一。其病原猪繁殖与呼吸综合征病霉（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）属于套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）成员之一,基因组为单股正链RNA,至少具有10个ORFs,即ORF1a、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3-7,及ORF5a基因。ORF1编码所有非结构蛋白,已知有14个非结构蛋白NSP1α、 Nsp1β、Nsp2-6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8-12。PRRSV变异、高致病毒株的出现与病毒引起的宿主免疫抑制及继发感染是PRRS的主要特征。虽然近年来国内外对该病毒致病机制研究取得了进展,但诱导免疫抑制的机理还有许多不解之谜。Nsp2是PRRSV编码的多功能蛋白,包括半胱氨酸酶区、高变区、跨膜区。Nsp2在调节宿主的先天性免疫应答与PRRSV致病过程中具有重要作用,但其结构和功能还有很多未知的方面。本研究旨在探明浙江地区近年PRRSV分离株的变异,初步解明PRRSV病毒感染细胞内Nsp2的分布定位、对IFN-β表达的影响及其可能的途径。本研究对2008-2012年间浙江地区流行的PRRSV毒株Nsp2、GP5、N基因序列进行了克隆与遗传演化分析。结果显示,流行毒株与与我国最早的分离的北美型毒株CH1a距离较近。PRRSV流行毒株中有22株Nsp2存在不连续的30个氨基酸缺失,占总毒株的38.6%（22/57）。流行毒株GP5在诱骗表位第29位、糖基化位点第34位、在胞外区第58、59位氨基酸处存在多种形式的氨基酸替换,GP5基因在进化过程中存在很高的变异性。N基因系统进化树将流行毒株分为3群（亚群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）,少数氨基酸发生了替换。以上结果说明中国华东地区流行毒株以北美型为主,Nsp2、GP5、N基因存在广泛的变异与多样性。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2蛋白均表达在细胞浆中；免疫印迹检测到约120与50kDa的Nsp2蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞浆；病毒感染后8h,可检测到120kDa左右的Nsp2蛋白条带；感染12h后可检测到70和50kDa左右的Nsp2蛋白,这些蛋白的表达量随着感染时间的延长（24-36h）显著增多。以上结果说明Nsp2是病毒复制过程中产生的早期病毒蛋白,在复制过程中产生不同亚型的Nsp2,这些亚型Nsp2在PRRSV致病过程中的具体作用还有待更进一步研究。RNA结合蛋白LSm14A是新发现的重要细胞抗病毒信号分子,能识别病毒双链RNA激活细胞内Ⅰ型IFN信号通路。PRRSV能够通过多种策略逃逸宿主的先天性免疫,抑制IFN-p的表达。本研究构建了猪源LSm14A分子的真核表达质粒,通过免疫印迹、激光共聚焦、双荧光报告系统、荧光定量等方法分析猪源LSm14A分子的天然免疫活性。结果表明：LSm14A在猪的不同组织中广泛表达；在HEK293与Marc-145细胞上过量表达LSm14A能显著激活IFN-β、NF-κB启动子,并且呈剂量依赖式协同poly （I：C）激活IFN-p启动子：PRRSV感染显著抑制外源LSm14A分子诱导的IFN-β启动子的活性；以上结果说明,LSm14A分子能够诱导IFN-β的表达,而PRRSV对这一效应可能具有拮抗作用。本研究建立了一株稳定表达Nsp2的细胞株11C1-HEK293,并且构建了Ⅰ型干扰素信号通路中的重要信号分子MAVS真核表达质粒。利用双荧光报告基因、荧光定量、免疫印迹与免疫荧光等方法,对Nsp2在调节Ⅰ型干扰素反应方面进行了研究。结果表明,信号分子MAVS能明显激活IFN-β启动子活性,促进IFN-p mRNA产生；病毒Nsp2能显著抑制poly（I:C）与信号分子MAVS、LSm14A诱导的IFN-β启动子活性与mRNA的转录；虽然我们初步观察到Nsp2与MAVS、 LSm14A存在共定位现象,但免疫荧光显示Nsp2不影响IRF3或NF-KB进入细胞核。因此,我们推测PRRSV逃逸宿主先天免疫的途径可能在细胞核内,可能通过影响IFN-p转录因子复合物的活性发挥其抗IFN-p作用。综上所述,猪源LSm14A具有激活IFN-β启动子活性,上调IFN-p mRNA水平,而PRRSV感染可以显著抑制poly（I:C）和LSm14A分子诱导的IFN-β启动子活性和转录水平。Nsp2蛋白在PRRSV感染细胞的胞浆内分布,并与信号分子MAVS和LSm14A共定位,但不影响IRF3或NF-κB入核,表明PRRSV对先天免疫的影响可能在细胞核内。研究结果将为深入研究PRRSV逃逸宿主天然免疫的分子机制奠定基础。
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标签：猪繁殖与呼吸综合征病毒论文; 非结构蛋白论文; 天然免疫论文;