抗癌药用植物喜树内生真菌NXZ-05菌株的次级代谢产物研究

论文摘要

近年来植物内生真菌已经成为研究活性天然产物的重要资源,并已从中分离出大量具有生理活性的化合物,由于其生境独特,很可能产生一些具有独特化学结构的次级代谢产物,从中发现与现有药物不同的新的活性物质,成为治疗肿瘤、感染、老年痴呆等顽疾的药物前体。喜树,为我国特有的药用植物,可以产生具有明显抗肿瘤活性的生物碱――喜树碱。在喜树组织――一个如此特殊的生境中,有可能存在特殊的内生真菌。此外,喜树内生真菌有可能在喜树碱的合成或转化中扮演着重要的角色。因此,我们有必要对喜树内生真菌的活性代谢产物进行研究。本文对分离自喜树枝条的内生真菌NXZ-05的次级代谢产物进行了研究。菌株NXZ-05经过ITS分子鉴定,确定为拟茎点霉Phomopsis（Sacc.） Bubak。以PDA, Czapek及GPY为培养基,对菌株NXZ-05进行培养基选择后,选择PDA进行琼脂表面发酵,对其次级代谢产物展开了初步的研究,从中分离到8个纯化合物。经过结构解析,确定T1为multiplolide A , T3为8-O-acetyl 5,6-dihydro-5,6-epoxymultiplotide A,T5为8-O-acetyl multipolide A,T13为5,6-dihydro-5,6-epoxymultiplotide A,T17为3,4-deoxy-3,4-did ehydromultiplod- ide A,它们均属于十元环内酯类化合物;T30为methyl （4E）-6,7,9-trihydr oxy-4-decenoate,T31为（4E）-6,7,9-trihydroxy-4-decenoic acid,T30,T31属于不饱和脂肪酸类化合物;T20为过氧麦角甾醇。经过CA检索,除A1和T20外,其余化合物T3,T5,T13,T17,T30,T31为新化合物。对分离到的8个纯化合物进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等生理活性测试。T5具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其IC50为5.7μmol/L,稍弱于AD治疗药物加兰他敏;此外,T5没有明显的细胞毒性。T1,T3,T5,T13对结核分支杆菌有较好的抗菌活性,它们对该菌株的MIC均为25μg/mL;但是,对其它试验指示菌――白色假丝酵母、啤酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌却没有明显的抗菌活性。T1和T20具有一定的抗肿瘤活性,T1对细胞株Raji的IC50为0.5μmol/mL,T20对Hela的IC50为0.1μmol/mL。上述化合物均没有抗氧化活性。本文还以GPY、YES、GPM、PD及Sabouraud为培养基,对菌株NXZ-05进行少量液体发酵,比较上述5种培养基的发酵产物,发现GPY的胞外产物具有显著的抗肿瘤活性。本文的研究结果表明,菌株NXZ-05具有较好的生理活性,其次级代谢产物中有一系列化学结构新颖的化合物,有继续研究的意义。化合物T5有潜力成为新型的AD治疗药物前体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 植物内生真菌及其代谢产物的研究进展
• 1.1 研究背景
• 1.2 植物内生真菌产生的主要活性物质
• 1.2.1 抗微生物活性物质
• 1.2.2 抗肿瘤活性物质
• 1.2.3 抗氧化物质
• 1.2.4 杀昆虫物质
• 1.2.5 其他活性化合物
• 2. 喜树及其内生真菌的研究进展
• 2.1 喜树的化学成分
• 2.2 喜树碱在喜树树体内的分布
• 2.3 提高从喜树中收获喜树碱量的方法
• 2.4 喜树碱及其衍生物的生物活性
• 2.4.1 抗肿瘤活性及其作用机理
• 2.4.2 其它生物活性
• 2.5 喜树碱类衍生物（CPTs）的构效关系
• 2.6 喜树内生真菌研究进展
• 3. 本课题研究目的、内容和意义
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 菌株来源
• 1.2 拮抗测定指示菌
• 1.3 肿瘤细胞株
• 1.4 常用试剂
• 1.4.1 细胞培养及细胞毒活性测试所用试剂
• 1.4.2 TLC 显色剂
• 1.4.3 乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型所用试剂
• 1.4.4 化学试剂
• 1.4.5 对有机自由基DPPH 的清除作用主要试剂
• 1.5 常用培养基
• 1.5.1 细胞培养基
• 1.5.2 马铃薯葡萄糖培养基（PD）
• 1.5.3 牛肉膏蛋白胨培养基（LB）
• 1.5.4 葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基（GPY）
• 1.5.5 Czapek 培养基
• 1.5.6 淀粉培养基（SYE）
• 1.5.7 麦芽汁培养基（GPM）
• 1.5.8 沙氏培养基（Sabouraud）
• 1.6 主要试剂及耗材
• 1.7 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 菌株的活化和培养
• 2.3 真菌培养及培养物处理
• 2.3.1 琼脂表面发酵
• 2.3.2 液体发酵
• 2.4 生物活性的测定
• 2.4.1 抗肿瘤活性测定
• 2.4.2 抗菌活性测定
• 2.4.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定
• 2.4.4 对有机自由基DPPH 的清除作用
• 2.5 天然产物的分离纯化
• 2.5.1 薄层层析（TLC）
• 2.5.2 硅胶柱层析
• 2.5.3 Sephadex LH-20 凝胶柱层析
• 2.5.4 中压液相色谱
• 2.5.5 重结晶
• 2.6 结构测定
• 2.6.1 质谱分析（MS）
• 2.6.2 NMR 测定
• 2.6.3 红外光谱分析
• 结果与分析
• 1. 琼脂表面发酵培养基的选择
• 1.1 细胞毒活性测定
• 1.2 乙酰胆碱酯酶抑制活性测定
• 1.3 抗菌活性测定
• 2. 菌株NXZ-05 琼脂表面发酵次级代谢产物的研究
• 2.1 菌株的发酵及培养物的处理
• 2.2 菌株次级代谢产物的分离纯化
• 2.2.1 菌株第一次琼脂表面发酵次级代谢产物的分离纯化
• 2.2.2 菌株第二次琼脂表面发酵次级代谢产物的分离纯化
• 3. 化合物的结构解析
• 3.1 化合物T1 的结构解析
• 3.2 化合物T5 的结构解析
• 3.3 化合物T3 的结构解析
• 3.4 化合物T13 的结构解析
• 3.5 化合物T17 的结构解析
• 3.6 化合物T31 的结构解析
• 3.7 化合物T30 的结构解析
• 3.8 化合物T20 的结构解析
• 4. 化合物的生物活性测定
• 4.1 化合物的抗菌活性测定
• 4.2 化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性测定
• 4.3 化合物的抗肿瘤活性测定
• 4.4 化合物的抗氧化活性测定
• 5. 液体发酵培养基选择
• 讨论与结论
• 1. 不同培养条件对发酵产物影响的讨论
• 2. 分离自菌株NXZ-05 次级代谢产物的生物活性化合物
• 2.1 十元环内酯类化合物
• 2.2 过氧麦角甾醇
• 3 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢