论文摘要
阿魏酸是在植物界中存在最广泛的羟基肉桂酸成分之一,因其具有去除活氧自由基、吸收紫外线、抑制色素生成及抗炎等作用,被广泛的应用于医药、化妆品及化工等行业。另外,阿魏酸与半纤维素、木素通过酯键交联,加强了三维的多糖网状结构,并且限制了纤维素的利用和微生物对于植物纤维类材料的降解。阿魏酸酯酶是半纤维素降解酶系的组成部分之一,它可以打断半纤维素之间的、半纤维素与木素之间交联的酯键,一方面促进半纤维素、木素与纤维素的分离,有利于纤维素的进一步利用；另一方面促进阿魏酸等酚酸类物质的分离。阿魏酸酯酶在生物乙醇生产、制浆造纸、动物饲料生产和生物合成中具有广泛的应用价值。本论文中,采用阿魏酸乙酯为唯一碳源的筛选培养基,根据产阿魏酸酯酶的菌株可在该平板上产生透明圈的特点,从土壤样品和实验室保藏的菌株中筛选到几株产阿魏酸酯酶菌株。进一步通过不断传代培养和液态发酵方式对菌种进行复筛,最终筛选得到一株产阿魏酸酯酶能力强的菌株4-3-a。通过扩增其18S rDNA片段和内转录间隔区序列（ITS）的方法对菌株进行鉴定,并结合菌株形态和菌体形态观察将该菌株鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus）。该菌株是有报道的第二株产阿魏酸酯酶的黄曲霉,其产酶能力与相关文献报道的菌株相比处于中上游水平。对用来测定阿魏酸酯酶酶活的底物去淀粉麦麸（DSWB）的制备方法进行了改进,通过研究证明,采用淀粉酶处理方法代替文献中使用的化学处理方法,可以使得麦麸中残留的淀粉含量达到测定酶活时对底物要求的水平。利用单因子实验、正交实验等统计学方法对于液态发酵培养基成分进行优化,得到较好的产酶培养基组成为：碳源6%,酵母浸粉0.4%,KH2PO40.05%,NaNO30.9%,MgSO40.05%。同时实验结果表明,碳源种类对阿魏酸酯酶的生产影响较大,其中以麦草粉、玉米秸秆粉和玉米芯粉为碳源时产阿魏酸酯酶情况较好。进一步利用混料设计方法对碳源的组成进行了优化,获得了最优的碳源配比,即当碳源总量为6%时,玉米杆和玉米芯的配比为36:64时可以获得最高的产酶效果。通过优化该菌株液体发酵生产阿魏酸酯酶的工艺参数,获得了最佳发酵工艺条件为：初始pH值为7.0,转速为210 rpm,培养温度为32℃,接种量为6%,装液量为100 mL（500 mL三角瓶）。经过对菌株4-3-a的液态发酵培养基成分及培养条件进行优化,使其产阿魏酸酯酶的水平提高2.5倍。利用混料设计实验方法优化混合碳源的组成,在国内尚属首次。对菌株4-3-a所产的阿魏酸酯酶进行酶学性质分析,当以去淀粉麦麸（DSWB）作为反应底物时,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为65℃；该酶在pH 5.0～7.0的微酸性环境中和50℃以下时有良好的稳定性；同时,该酶对溶解合成底物用的40%及以下的乙醇具有良好的耐受性。卡伯值测定和红外光谱分析表明麦草经过菌株液态发酵处理后,木素含量有所减少,酯键和木素的特征吸收都有不同程度的降低,证实了阿魏酸酯酶的作用；进一步分析发现,菌液处理后麦秸中阿拉伯糖含量降低显著,说明阿魏酸酯酶可以促进阿拉伯木聚糖的溶出。采用热水处理然后磨浆的方式,可以在大量保留酯键的基础上使麦秸结构变得疏松,有利于后续的酶解进行。纤维素酶解时添加阿魏酸酯酶,可以改善底物的酶解糖化效果,也可以在保持较高纤维素转化率的前提下,通过添加阿魏酸酯酶减少纤维素酶用量。