凋亡细胞诱导免疫负相调控及其相关机制的研究

论文摘要

肝脏是一个特殊的免疫耐受器官,在肝脏内极易诱导免疫耐受。肝脏又是衰老的红细胞和中性粒细胞的坟墓,另有报导,肝脏能够捕获活化的CD8+T细胞并诱导它们凋亡。这一系列的现象表明,肝脏可能是清除血液中凋亡的白细胞的主要部位,而Kupffer细胞是肝脏内定居的专职吞噬细胞,所以我们设想Kupffer细胞可能是肝脏内主要的凋亡细胞吞噬细胞并可能主动参与肝脏内免疫耐受的诱导与维持。凋亡细胞的存在通常伴随着免疫抑制。虽然在炎症消退和组织重塑过程中,与凋亡细胞相接触的巨噬细胞能够获得免疫调节的特征,但是树突状细胞（DC）和单核细胞也表现有类似的性质,即产生促炎症因子的减少,抗炎症因子如TGF-β、IL-10的增多。已有报道,凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PS）在其中起到重要作用,而且携带PS的囊泡可以模拟凋亡细胞的这种抗炎症作用,但其机制仍然不清楚。此外,IL-10是一种重要的免疫调节细胞因子。大量的研究表明IL-10在炎症的消退中起到关键的作用。已有研究证明,IL-10的产生与吞噬细胞促炎症因子的减少相伴行,凋亡细胞刺激巨噬细胞后,4小时巨噬细胞即有IL-10产生,该反应至少部分依赖于巨噬细胞表面CD36并通过P38 MAPK信号途径。为了研究凋亡细胞在体内对于免疫功能以及炎症反应的调控作用,我们在本研究中制备凋亡细胞模型并观察了其回输体内后对于免疫和炎症反应的影响,随后分析了其相关的作用机制。我们利用羧乙基锗倍半氧化物（CFSE）染色凋亡细胞来进行示踪实验,将标记的凋亡细胞回输到体内,发现凋亡细胞在4小时之内被迅速清除干净。实验数据显示,通过静脉注射的凋亡的活化细胞或者血白细胞和经门静脉注射的凋亡细胞主要在肝内被Kupffer细胞捕获,而经静脉注射的凋亡的未经刺激的脾细胞却主要在脾脏内被捕获。这表明不仅凋亡细胞输入的途径,而且回输的细胞在凋亡诱导之前的状态都与凋亡细胞被吞噬的部位有关。我们又分别用氯化钆（GdCl3）来抑制Kupffer细胞的功能,用CD11c-DTR转基因小鼠注射白喉毒素（Diphtheria toxin,DT）删除DC,或者注射细胞松弛素B来阻断所有巨噬细胞和DC的吞噬作用来观察体内凋亡细胞的清除,结果发现凋亡细胞在肝内主要被Kupffer细胞吞噬,而不是通过DC被吞噬。用脾脏、腹腔来源的巨噬细胞或者Kupffer细胞进行吞噬凋亡细胞的体外实验,结果发现,与脾脏和腹腔来源的巨噬细胞相比,Kupffer细胞具有更加显著的吞噬凋亡细胞的能力。同时注射LPS和D-GalN诱导小鼠肝炎发生是常用的暴发性肝炎小鼠模型。我们发现,应用凋亡细胞预处理小鼠能够明显地抑制肝炎的发生,并且凋亡细胞预处理对肝炎的这种保护作用以凋亡细胞经门经脉输入、回输的凋亡细胞数量在1×107到3×107之间、凋亡细胞输入后间隔3到7天再诱导肝炎时的保护效果最好,同时,GdCl3注射能够取消这种保护效应,但是用CD11c-DTR转基因小鼠删除体内DC或者用抗CD25单克隆抗体体内清除调节性T细胞都不能影响这种保护效应,表明凋亡细胞诱导小鼠产生的肝炎保护效应是由肝脏Kupffer细胞介导的。提示Kupffer细胞发挥有效的免疫调节需要经过一段特定的时间,时间太短则未充分诱导负相免疫调节,时间太长可能新的细胞更新或者自动失去了调节特征,而凋亡细胞的剂量依赖性表明如果凋亡细胞过多,可能不能及时清除而发生坏死,释放炎症介质破坏了负相免疫调节的诱导环境。为了探讨相关的作用机制,我们分离并培养来自野生C57BL/6小鼠的Kupffer细胞,观察了与凋亡细胞共同作用后对Kupffer细胞的形态、表型、细胞因子分泌的影响。在Kupffer细胞与凋亡细胞共同培养3天后,给Kupffer细胞予LPS刺激,瑞氏—吉姆萨染色发现经凋亡细胞处理后Kupffer细胞形状变长,经LPS刺激后贴壁更加紧密,细胞向四周延伸。其共刺激分子这一类表型没有明显的变化,但是其促炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6等产生减少,而抗炎症因子TGF-β、IL-10分泌增加。上述实验数据表明,Kupffer细胞是凋亡细胞体内诱导肝炎保护效应的细胞。进一步研究发现,凋亡细胞不能体内诱导IL-10缺陷小鼠产生肝炎保护效应,而且,以GdCl3去除野生型小鼠体内的Kupffer细胞后,再回输与凋亡细胞体外共培养过的野生型Kuppfer细胞,可以产生肝炎保护作用,而输入与凋亡细胞体外共培养过的IL-10缺陷的Kupffer细胞,则不能产生肝炎保护效应。表明IL-10在凋亡细胞体内诱导肝炎保护中起重要作用。我们检测了给予凋亡细胞并诱导肝炎的小鼠血清中IL-10的含量,发现这些小鼠模型在肝炎诱导后4小时IL-10含量显著升高,而GdCl3体内应用可抑制IL-10的升高。从而进一步证实了Kupffer细胞分泌的IL-10是凋亡细胞体内诱导肝炎保护效应的重要因素。为了确定IL-10产生增多的机制,我们分别用Transwell隔离Kupffer细胞和凋亡细胞、用凋亡细胞的培养上清刺激Kupffer细胞和细胞松弛素B抑制吞噬等方法,表明凋亡细胞诱导Kupffer细胞表达IL-10升高不依赖于可溶性的分子,不依赖于吞噬过程,而依赖于凋亡细胞与Kupffer细胞间直接接触。在细胞共培养前,先用抗TGF-β抗体来处理凋亡细胞,再来刺激Kupffer细胞,其IL-10的产生效应大大降低;将凋亡细胞与Smad3缺陷的Kupffer细胞共培养,不能够明显促进Kupffer细胞产生IL-10,表明TGF-β参与了促进IL-10产生的过程。但是体外用重组的可溶性TGF-β来刺激Kupffer细胞,却不能够明显促进其产生IL-10,这表明并非可溶性的TGF-β,而可能是膜结合型的TGF-β发挥了作用。流式细胞检测证实,在经过紫外线照射后,脾细胞表面出现膜结合型的TGF-β,在照射后4小时发生明显凋亡的同时,其细胞表达膜结合型的TGF-β的比例高达56.9%。RT-PCR方法检测表明,Kupffer细胞中IL-10产生增多有赖于转录。用ERK活化阻断剂PD98059实验表明,在ERK的活化受到抑制后,IL-10的产生大大降低。在凋亡细胞与Kupffer细胞共孵育半小时后,用Phosflow的方法检测ERK的磷酸化,表明凋亡细胞能够明显地活化Kupffer细胞的EKR途径,而中和性的TGF-β抗体处理凋亡细胞则使得EKR的活化水平明显下降。这表明凋亡细胞表面膜结合型的TGF-β参与启动Kupffer细胞的ERK信号途径,进而促进IL-10的产生。我们在体外测定了Kupffer细胞对肝细胞的杀伤活性。Kupffer细胞在经LPS/D-GalN刺激后能够显著地杀伤肝细胞,而经过与凋亡细胞共培养的Kupffer细胞则杀伤能力大大降低。我们在培养系统中加入抗TNF-α抗体和iNOS抑制剂,Kupffer细胞的杀伤能力也会大大降低。通过测定上清中的TNF-α和NO,我们发现凋亡细胞与Kupffer细胞孵育使其受刺激后产生的TNF-α和NO大大降低,而高水平的IL-10在下调二者的过程中起到重要作用。综上所述,凋亡细胞可以通过其表面的膜结合型TGF-β激活Kupffer细胞的ERK相关信号途径,诱导IL-10产生增多,高水平的IL-10又可能通过自分泌或者旁分泌效应抑制了TNF-α和NO的产生,从而起到肝炎保护作用。本实验结果从凋亡细胞、Kupffer细胞、负相免疫调控乃至免疫耐受之间相互关系的角度,为凋亡细胞负相调节免疫功能并抑制炎症反应的机制提供了新的理论依据。

论文目录

• 缩写
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 1.Kupffer细胞是肝脏内主要的凋亡细胞的吞噬细胞
• 2.凋亡细胞的清除抑制Kupffer细胞介导的内毒素诱发肝炎
• 3.凋亡细胞的吞噬影响了Kupffer细胞的形态、表型和细胞因子的分泌
• 4.Kupffer细胞来源的IL-10介导了凋亡细胞对内毒素肝炎的保护效应
• 5.凋亡细胞表面的膜结合型TGF-β促进Kupffer细胞分泌IL-10
• 6.膜结合型TGF-β通过活化ERK途径诱导Kupffer细胞分泌IL-10
• 7.凋亡细胞的吞噬降低了Kupffer细胞对肝细胞的细胞毒性
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述 凋亡细胞的清除对免疫稳态的调节
• 致谢
• Acknowledgement
• 博士期间的相关工作