CRAd.pEgrl-TRAIL-Smac联合放射对MDA-MB-231细胞杀伤效应的研究

论文摘要

恶性肿瘤作为一种全身性疾病，其产生是由多基因、多途径及多因素参与逐步发展的复杂过程，单一疗法往往难以取得满意疗效，因此，合理地选择综合治疗的模式为有效地杀伤肿瘤细胞，彻底治愈癌症带来了希望。肿瘤基因-放射治疗的提出弥补了放射治疗与基因治疗各自的弊端，将二者有机地结合起来，发挥协同抗肿瘤作用，既增强了肿瘤组织对放射治疗的敏感性、提高外源基因靶向转移和杀伤肿瘤细胞的效率，同时也可以降低照射剂量，缓解射线对肿瘤周围正常组织的损伤。本研究利用对肿瘤细胞具有靶向性的溶瘤腺病毒作为载体，利用Egr-1启动子可在辐射诱导下增强其下游目的基因表达的特性，以及TRAIL和Smac基因的协同促肿瘤细胞凋亡的作用，构建了携带TRAIL和Smac双基因的具有双重靶向的pAd.Egr1-TRAIL-Smac-hTERT-E1A-E1B-E1B55K的溶瘤腺病毒质粒，并在HEK293细胞中成功地将其包装成携带Egr-1启动子、TRAIL和Smac双基因的双重靶向溶瘤腺病毒CRAd.pEgr1-TRAIL-Smac，探讨在其联合X射线照射对MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响，以及MDA-MB-231细胞凋亡途径中相关基因的mRNA和蛋白表达规律。实验结果表明，CRAd.pEgr1-TRAIL-Smac联合X射线照射对MDA-MB-231细胞具有明显的增殖抑制及其促凋亡作用，可使细胞中TRAIL、DR5、Smac、Cytc、caspase-8、-9和-3mRNA及蛋白表达增高。结果提示，CRAd.pEgr1-TRAIL-Smac联合放疗抑制MDA-MB-231细胞增殖和促进其凋亡的机制，涉及细胞S期和G2期阻滞及死亡受体途径与线粒体途径中TRAIL、DR5、Smac、Cytc、caspase-8、-9和-3等基因的相互作用。本研究结果为临床治疗肿瘤提供了重要的理论依据及实验基础。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 肿瘤的基因治疗
• 1.1.1 基因治疗的发展及现状
• 1.1.2 肿瘤基因治疗
• 1.2 肿瘤放射治疗
• 1.3 肿瘤的基因放射治疗
• 1.3.1 肿瘤基因-放射治疗的种类
• 1.3.2 由Egr-1启动子介导的肿瘤基因-放射治疗
• 1.4 溶瘤病毒与肿瘤治疗
• 1.4.1 腺病毒的基本生物学特征
• 1.4.2 腺病毒载体发展过程
• 1.4.3 条件复制型腺病毒载体
• 1.4.4 条件复制型腺病毒与肿瘤的治疗
• 1.5 TRAIL基因与肿瘤治疗
• 1.5.1 TRAIL基因的分子结构与生物学特性
• 1.5.2 TRAIL基因与细胞凋亡
• 1.5.3 TRAIL基因与肿瘤治疗
• 1.6 SMAC基因与肿瘤治疗
• 1.6.1 Smac基因的分子结构及及生物学特性
• 1.6.2 Smac与细胞凋亡
• 1.6.3 Smac与肿瘤治疗
• 1.7 立题依据
• 第2章 材料与方法
• 2.1 主要试剂及实验器材
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 实验器材
• 2.2 主要实验仪器
• 2.3 细胞株
• 2.4 质粒与菌株
• 2.5 照射条件
• 2.6 细胞生物学实验方法
• 2.6.1 培养液配制
• 2.6.2 胎牛血清的制备
• 2.6.3 平衡盐溶液的配制
• 2.6.4 0.25%胰酶溶液的配制
• 2.6.5 细胞培养
• 2.6.6 细胞冻存
• 2.6.7 细胞复苏
• 2.6.8 CCK-8试剂盒检测细胞增殖
• 2.6.9 检测细胞凋亡
• 2.6.10 FCM法检测细胞周期
• 2.7 分子生物学实验方法
• 2.7.1 细菌培养技术
• 2.7.2 重组穿梭载体的构建
• 2.7.3 重组腺病毒的包装与鉴定
• 2.7.4 目的基因蛋白表达水平的检测
• 2.8 统计学方法
• 第3章 实验结果
• 3.1 重组质粒的构建及鉴定
• 3.1.1 目的基因的获得
• 3.1.2 重组质粒pShuttle-Egr1-TRAIL-Smac-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定
• 3.2 重组腺病毒的包装及鉴定
• 3.2.1 重组腺病毒质粒构建
• 3.2.2 重组腺病毒的包装
• 3.2.3 重组腺病毒的扩增
• 3.2.4 重组腺病毒滴度的测定
• 3.2.5 重组腺病毒的鉴定
• 3.3 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB-231细胞的杀伤作用
• 3.3.1 重组腺病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响
• 3.3.2 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB- 231细胞增殖的影响
• 3.3.3 重组腺病毒联合2.0GyX射线照射对MDA-MB- 231细胞凋亡的影响
• 3.3.4 重组腺病毒联合2.0GyX射线照射对MDA-MB- 231细胞周期进程的影响
• 3.4 重组腺病毒在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的辐射诱导表达规律
• 3.4.1 2.0GyX射线照射后重组腺病毒感染的MDA- MB- 231细胞中TRAIL、Sm ac、DR5 、Cytc 、caspase-8、-9和- 3基因mRNA的表达变化
• 3.4.2 2.0GyX射线照射后重组腺病毒感染的MDA-MB-231细胞中TRAIL、smac、Cytc、DR5、caspase-9、-8和-3基因蛋白表达的变化
• 第4章 讨论
• 4.1 条件复制型腺病毒载体构建及病毒包装
• 4.2 重组腺病毒联合2.0GYX射线照射对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤作用
• 4.2.1 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用
• 4.2.2 重组腺病毒联合X射线照射对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡及其周期进程的影响
• 4.2.3 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB-231细胞中凋亡相关基因的表达影响
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及其他成果
• 致谢