橡胶树HbJAZ1基因的互作蛋白筛选研究

论文摘要

天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）,乳管是橡胶树合成和贮存胶乳的重要器官。机械损伤和外施茉莉酸能够诱导乳管分化和形成,说明茉莉酸是调控橡胶树乳管分化的重要信号分子。JAZ蛋白是植物茉莉酸信号调控途径中重要的负调控因子。JAZ与茉莉酸调节的转录因子互作,从而抑制其转录活性,但目前已知的与JAZ互作的蛋白还很少。为了研究橡胶HbJAZ1基因的功能以及鉴定巴西橡胶树中与JAZ蛋白特异性结合的蛋白,本文采用两种方法进行研究：（一）对HbJAZ1进行原核表达和GST融合蛋白的分析纯化；（二）构建HbJAZ1基因的pGBKT7诱饵载体,用于酵母双杂交筛选。实验结果如下：（1）通过RT-PCR成功扩增HbJAZ1基因,测序结果表明,与Genebank中登录号为GQ369508.1报道的HbJAZ1基因同源性为99%；（2）利用pGEX-6p-1载体构建HbJAZ1基因的GST融合表达载体并转化BL21大肠杆菌感受态融合表达蛋白的诱导条件筛选；（4）利用谷胱甘肽-琼脂糖填料成功纯化HbJAZ1-GST融合表达蛋白,并发现HbJAZ1融合表达蛋白在大肠杆菌原核表达中可能是难溶蛋白,大多存在于裂解菌液的不溶沉淀物中。（5）成功构建HbJAZ1基因的pGBKT7诱饵载体并转化Y2HGold酵母宿主,PCR检测验证诱饵载体成功转化并且在橡胶胶乳cDNA文库中,筛选出4个互作蛋白。该文利用蛋白体外互作和酵母双杂交技术筛选橡胶与HbJAZ1基因互作蛋白,探讨茉莉酸信号途径调控机制,为进一步研究橡胶产胶机理打下良好基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 橡胶树乳管分化与产胶机理的研究
• 1.1.1 橡胶乳管分化的研究
• 1.1.2 橡胶合成相关基因
• 1.1.3 茉莉酸与产胶的关系
• 1.2 茉莉酸信号途径及其研究进展
• 1.2.1 茉莉酸的生物合成及其调节
• 1.2.2 茉莉酸类物质信号途径的作用机制
• 1.2.3 JAZ基因家族的研究进展
• 1.3 酵母双杂交系统
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 研究技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 工具酶和试剂
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 橡胶树叶片HbJAZ1基因克隆
• 2.2.1.1 橡胶树叶片RNA提取
• 2.2.1.2 RNA甲醛变性电泳检测
• 2.2.1.3 RNA浓度测定
• 2.2.1.4 叶片RNA中DNA的消化
• 2.2.1.5 叶片cDNA第一链合成
• 2.2.1.6 HbJAZ1基因的克隆
• 2.2.2 HbJAZ1基因的原核表达及纯化
• 2.2.3 酵母双杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 巴西橡胶树叶片RNA的提取以及反转录
• 3.2 HbJAZ1基因的克隆及测序
• 3.3 构建HbJAZ1表达载体
• 3.4 蛋白质表达及发酵条件的优化
• 3.5 GST-HbJAZ1蛋白的纯化
• 3.6 酵母双杂交
• 3.6.1 诱饵载体的构建及酵母转化
• 3.6.2 pGBKT7-HbJAZ1诱饵载体转化酵母菌株的自转录激活鉴定诱
• 3.6.3 阳性克隆的筛选
• 4 讨论
• 4.1 巴西橡胶树叶片总RNA的提取及反转录
• 4.2 表达载体的构建及其转化
• 4.3 发酵条件优化与表达蛋白质的纯化
• 4.4 酵母双杂交系统
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 附录