鸭肠炎病毒gC基因疫苗诱导BALB/c小鼠免疫发生的研究

论文摘要

鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）又称鸭瘟（Duck piague, DP）由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）;引起的,发生于鸭、鹅及多种雁形目动物的一种的急性、高度接触性传染病。基因疫苗以其独特的优势在基因工程疫苗研究中备受关注。本研究对DEV gC的理论免疫原性和gC基因疫苗对BALB/c小鼠的免疫原性及其免疫佐剂等开展系列研究,获得以下结果：1.鸭肠炎病毒gC基因免疫原性理论预测：同源性分析显示DEV gC与MDV-1、MDV-2 gC的同源性最高和亲缘关系最近；功能预测显示DEV gC可能属于免疫反应基因范畴,具有细胞外膜蛋白功能和酶性质,但不属于任何一种酶类,进一步对其结构与功能预测发现21～54、48～68、160-200aa可能与肝素结合有关,29-110aa与gC阻碍备解素与C3b结合有关,168-225和254-332aa与gC与C3b结合有关；细胞表位的预测显示DEV gC存在丰富的T和B细胞表位,表明DEV gC可能具有良好免疫原性。2.壳聚糖作为pcDNA-DEV-gC疫苗递送载体：制备和生物学特性研究：壳聚糖/DEV gC基因疫苗复合物制备标准化,具有较高的重现性,包封率为95.6%±0.8,形态均一,呈球形,直径在50-80nm之间,4℃能够稳定保存,低质粒降解率,转染率较好,低细胞毒性。因此,壳聚糖是DEV gC基因疫苗安全有效递送载体。3.阳性脂质体作为pcDNA-DEV-gC疫苗递送载体：制备和生物学特性研究：阳性脂质体/DEV gC基因疫苗复合物制备标准化,具有较高的重现性,包封率为76.4%±0.8,形态均一,呈球形,直径在400-700nm之间,4℃能够稳定保存,低质粒降解率,转染率高,低细胞毒性。因此,阳性脂质体是DEV gC基因疫苗安全有效的递送载体。4.检测鼠抗DEV特异性血清IgG和肠道分泌IgA的间接ELISA方法的建立：两种间接ELISA方法的抗原包被浓度分别为0.5pg／ml和1μg／ml,一抗工作浓度分别为1：8和原液,酶标抗体工作浓度为1：5000和1：8000,一抗孵育温度和时间都为37℃1h,酶标抗体孵育温度和时间分别为37℃1h和37℃2h,底物作用时间都为40min,阴阳性临界值分别为0.259和0.297,具有良好的特异性和重复性,为基因疫苗的体液免疫和粘膜免疫检测提供了稳定的检测方法。5.鸭肠炎病毒gC基因疫苗诱导BALB/c小鼠免疫发生的研究：pcDNA-DEV-gC基因疫苗能够诱导小鼠产生一定程度的细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。基因枪轰击和肌注途径诱导T淋巴细胞增殖、CD4+和CD8+T淋巴细胞免疫应答优于口服途径,基因枪轰击诱导体液免疫应答的能力较肌注和口服途径强,三种免疫途径中仅口服途径产生黏膜反应。基因枪轰击细胞和体液免疫应答具有一定的剂量相关性,而肌肉注射仅在细胞免疫方面。递送载体可显著提高机体的细胞免疫和粘膜免疫水平,其中阳性脂质体偏重细胞免疫,壳聚糖偏重粘膜免疫,具有良好的佐剂效应。与弱毒疫苗相比,基因疫苗诱导细胞免疫应答的能力优于弱毒疫苗,而弱毒疫苗诱导体液免疫的能力更强。

论文目录

• 论文的创新性工作
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述及选题目的和意义
• 第一章 疱疹病毒gC基因工程疫苗的研究进展
• 1. gC的功能
• 1.1 gC在病毒防御方面的功能
• 1.2 gC在病毒攻击方面的功能
• 2. gC潜在的疱疹病毒疫苗策略
• 2.1 基于gC的防御作用
• 2.2 基于gC的攻击作用
• 3. gC基因工程疫苗的研究与应用
• 3.1 基因缺失减毒活疫苗
• 3.2 重组亚单位疫苗
• 3.3 重组病毒活载体疫苗
• 3.4 DNA疫苗
• 4. 展望
• 5. 选题目的和意义
• 第二部分 实验研究
• 第二章 鸭肠炎病毒gC基因免疫原性理论预测
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 2.1 DEV gC同源性分析
• 2.2 DEV gC二级结构预测
• 2.3 DEV gC功能区的预测
• 2.4 DEV gC T细胞表位的预测
• 2.5 DEV gC B细胞表位的预测
• 3. 结果
• 3.1 DEV gC同源性分析
• 3.2 DEV gC二级结构预测
• 3.3 DEV gC功能区的预测
• 3.4 DEV gC T细胞表位的预测
• 3.5 DEV gC B细胞表位预测
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第三章 壳聚糖作为pcDNA-DEV-gC疫苗递送载体:制备和生物学特性研究
• 1. 实验材料
• 1.1 载体和细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 壳聚糖/pcDNA-DEV-gC复合物制备
• 2.2 壳聚糖/pcDNA-DEV-gC复合物对质粒包封率的测定
• 2.3 壳聚糖/pcDNA-DEV-gC复合物形态和粒径的测定
• 2.4 酶降解保护试验
• 2.5 体外细胞毒性试验
• 2.6 体外转染实验
• 3. 结果
• 3.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳初步检测复合物制备效果
• 3.2 壳聚糖/pcDNA-DEV-gC复合物对质粒的包封率
• 3.3 壳聚糖/pcDNA-DEV-gC复合物的形态和粒径
• 3.4 酶降解保护试验
• 3.5 体外转染实验
• 3.6 体外细胞毒性实验
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第四章 阳性脂质体作为pcDNA-DEV-gC疫苗递送载体制备和生物学特性研究
• 1. 实验材料
• 1.1 载体和细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC复合物制备
• 2.2 阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC复合物对质粒包封率的测定
• 2.3 阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC复合物形态和粒径的测定
• 2.4 酶降解保护试验
• 2.5 体外细胞毒性试验
• 2.6 体外转染实验
• 3. 结果
• 3.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳初步检测复合物制备效果
• 3.2 阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC复合物对质粒的包封率
• 3.3 阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC复合物的形态和粒径
• 3.4 酶降解保护试验
• 3.5 体外转染实验
• 3.6 体外细胞毒性实验
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第五章 间接ELISA检测鼠抗DEV特异性血清IgG和肠道IgA方法的建立
• 1. 实验材料
• 1.1 毒株和细胞
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 鼠抗DEV多克隆抗体制备
• 2.2 建立检测鼠抗DEV特异性IgG和IgA的间接ELISA方法
• 3. 实验结果
• 3.1 鼠抗DEV多克隆抗体效价测定
• 3.2 建立检测鼠抗DEV特异性IgG和IgA的间接ELISA方法
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第六章 鸭肠炎病毒gC基因疫苗诱导BALB/c小鼠免疫发生的研究
• 1. 实验材料
• 1.1 毒株、质粒、疫苗和基因枪"子弹"
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器和软件
• 2. 试验方法
• 2.1 阳性脂质体和壳聚糖/pcDNA-DEV-gC基因疫苗纳米粒的制备
• 2.2 实验分组及免疫
• 2.3 样品采集及处理
• 2.4 外周血T淋巴细胞转化实验
• 2.5 T淋巴细胞亚群数量变化的检测
• 2.6 间接ELISA方法检测抗体水平
• 2.7 微量中和试验检测血清抗体
• 3. 结果
• 3.1 疫苗免疫小鼠后的实验结果
• 3.2 基因疫苗不同免疫途径免疫小鼠后的效果比较
• 3.3 基因疫苗不同免疫剂量免疫小鼠后的效果比较
• 3.4 不同递送载体的比较
• 3.5 基因疫苗与弱毒疫苗免疫小鼠后的效果比较
• 3.6 微量中和试验结果
• 4. 讨论
• 4.1 机体免疫应答与病毒感染的关系
• 4.2 小鼠免疫基因疫苗后外周血T淋巴细胞转化效果
• 4.3 小鼠免疫基因疫苗后CD4+和CD8+T淋巴细胞动态变化
• 4.4 小鼠免疫基因疫苗后血清抗体IgG的动态变化
• 4.5 小鼠免疫基因疫苗后肠道抗体IgA的动态变化
• 4.6 小鼠免疫基因疫苗后中和抗体的变化
• 4.7 免疫剂量对基因疫苗免疫效果的影响
• 4.8 免疫途径对基因疫苗免疫效果的影响
• 4.9 递送载体对基因疫苗免疫效果的影响
• 4.10 小鼠免疫基因疫苗和弱毒疫苗后免疫效果的比较
• 4.11 影响基因疫苗免疫效果的因素
• 4.12 鸭肠炎病毒gC基因疫苗的研究意义及展望
• 5. 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介