利用病毒介导沉默技术高通量鉴定马铃薯晚疫病水平抗性相关基因功能

论文摘要

病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）技术是一种RNA介导的植物抗病毒防御反应机制,VIGS实验技术应用在基因功能研究和高通量基因组研究中能够高效快速的鉴定基因功能缺失后表观性状改变。马铃薯晚疫病水平抗性是一种由微效多基因控制的,具有非小种专化性的数量抗性。其抗病程度虽然不及垂直抗性,但是对很多生理小种均有抗性,并且有着多重的抗病机制,具有广谱性、持久性和稳定性,同时能够降低晚疫病生理小种的选择压力,一定程度上延缓病原菌的变异。为了解晚疫病水平抗性的分子基础,明确水平抗性形成过程中相关基因在抗性网络中的位置与重要性,本研究挑选马铃薯晚疫病水平抗性相关基因,在本氏烟草利用VIGS技术沉默目标基因,对目标基因沉默烟草进行晚疫病抗性鉴定,筛选沉默后晚疫病抗性显著降低的目标基因作为马铃薯晚疫病水平抗性重要侯选基因。主要实验结果如下：1.挑选晚疫病水平抗性相关基因,与本氏烟草cDNA数据库比对得到45个与本氏烟草同源性较高,并且含有23bp以上连续匹配序列的ESTs作为实验筛选的目标基因片段。2.根据已知序列设计引物扩增获马铃薯cDNA,扩增获得38个目标基因片段,构建了TRV病毒重组载体,并将其转入农杆菌GV3101。3.在本氏烟草材料用VIGS技术将与目标基因同源性较高的内源基因进行沉默。RT-PCR技术鉴定了部分本氏烟草内源目标基因沉默效果,确定VIGS实验体系能够达到沉默烟草内源目标基因的目的。4.将沉默目标基因的本氏烟草进行晚疫病抗性鉴定,筛选得到晚疫病抗性与对照材料比较有显著差异的12个目标基因。初步确定这12个目标基因是晚疫病水平抗性重要基因。综上,本研究利用VIGS技术高通量在烟草中鉴定了38个马铃薯水平抗性相关基因功能,筛选出12个可能在马铃薯晚疫病水平抗性中具有重要作用的基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 马铃薯晚疫病及其抗病分子机理
• 1.1.1 马铃薯晚疫病及其危害
• 1.1.2 马铃薯晚疫病菌
• 1.1.3 马铃薯晚疫病抗性分子机理
• 1.2 病毒诱导基因沉默现象与VIGS技术
• 1.2.1 病毒诱导基因沉默的发现
• 1.2.2 VIGS技术的原理与研究进展
• 1.2.3 VIGS技术的优点与不足
• 1.3 本课题的提出及研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料、晚疫病病原菌、菌株和质粒
• 2.2 目标基因EST片段的选择与克隆
• 2.3 瞬时干涉沉默载体构建
• 2.3.1 质粒酶切及目标片段连接
• 2.3.2 大肠杆菌热击感受态制备及转化
• 2.3.3 载体酶切检测与测序
• 2.3.4 农杆菌电击感受态细胞的制备及转化
• 2.4 TRV病毒介导的VIGS瞬时沉默体系
• 2.4.1 根癌农杆菌菌液制备
• 2.4.2 TRV病毒介导VIGS根癌农杆菌注射法
• 2.5 实验处理植株内源基因RT-PCR表达分析
• 2.6 晚疫病原菌的繁殖与接种
• 2.6.1 燕麦培养基配置与病原菌繁殖法
• 2.6.2 病原菌块茎薄片繁殖法
• 2.6.3 晚疫病接种鉴定方法
• 3 结果与分析
• 3.1 晚疫病水平抗性相关基因cDNA芯片中ESTs挑选结果
• 3.2 目标基因片段扩增
• 3.3 VIGS瞬时沉默载体的构建
• 3.4 本氏烟草VIGS实验
• 3.5 RT-PCR检测内源目标基因表达
• 3.6 晚疫病抗性鉴定实验
• 3.7 重要候选基因信息分析
• 4 讨论
• 4.1 影响目标基因沉默的VIGS实验因素
• 4.1.1 目标片段大小与载体片段插入方向对VIGS实验的影响
• 4.1.2 环境与苗龄对VIGS实验的影响
• 4.2 利用VIGS技术在本氏烟草进行高通量基因功能鉴定
• 4.3 马铃薯晚疫病水平抗性重要侯选基因
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 引物信息
• 附录2 TRV重组载体测序
• 2'>附录3 2010年5月马铃薯基因病毒诱导沉默接种P.INFESTANS混合生理小种3天后病斑面积MM²
• 2'>附录4 2010年8月马铃薯基因病毒诱导沉默接种P.INFESTANS混合生理小种3天后病斑面积MM²
• 2'>附录5 2010年10月马铃薯基因病毒诱导沉默接种P.INFESTANS混合生理小种3天后病斑面积MM²