论文摘要
很多证据表明硒化合物具有抑制肿瘤发生的化学预防作用,最近研究表明硒化合物可能具有成为化疗药物用于肿瘤治疗的潜能,在一定剂量范围内对肿瘤细胞具有一定的选择性抑制生长和诱导凋亡的作用而正常细胞耐受较好。结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国的发病率呈上升趋势,我们利用多种体外培养的结肠癌细胞系和裸鼠结肠癌移植瘤模型证明超营养剂量的亚硒酸钠在体内体外均能诱导细胞凋亡。亚硒酸钠诱导细胞凋亡的机理目前仍不很清楚,我们研究了Bcl-2家族蛋白在亚硒酸钠诱导凋亡过程中发挥的作用,并进一步分析了亚硒酸钠诱导Bax激活的分子机制。通过多种细胞凋亡检测技术,我们在SW480、HCT116、HT29三种结肠癌细胞系中证明5-10μM亚硒酸钠能诱导典型细胞凋亡,并诱发细胞色素C从线粒体释放至胞浆,说明内源性线粒体凋亡通路被激活。Bcl-2家族蛋白是重要的细胞凋亡调节因子,其与线粒体凋亡通路具有密切联系,在SW480细胞凋亡的研究中我们发现亚硒酸钠能诱导Bax从胞浆转位至线粒体,本文主要研究Bax这个关键分子在亚硒酸钠诱导细胞凋亡中的作用。将GFP标记的Bax在SW480细胞中稳定表达,我们构建了可实时观察Bax功能状态变化的细胞模型。利用这个模型,我们进一步发现亚硒酸钠诱导了Bax构象变化、迁移至线粒体、多聚体形成和细胞色素C释放这一系列事件,并明确了这些事件的先后顺序。在此体系中高表达抗凋亡Bcl-2家族成员Bcl-xL能显著抑制亚硒酸钠诱导的Bax构象变化、迁移至线粒体、多聚体形成和细胞色素C释放。在明确亚硒酸钠激活Bax这一现象之后,我们利用基因缺失的细胞模型分析了Bax对于亚硒酸钠诱导细胞凋亡的重要性。Bax/Bak双缺失的MEF细胞与野生型MEF细胞相比对亚硒酸钠诱导的细胞死亡具有很强抗性,Bax单缺失的HCT116结肠癌细胞与野生型HCT116细胞相比对亚硒酸钠诱导的细胞死亡敏感性降低,说明Bax是亚硒酸钠诱导细胞死亡的重要介导分子。我们进一步分析了亚硒酸钠诱导Bax激活的分子机制,发现在SW480细胞中亚硒酸钠能诱导细胞内ROS水平持续性升高。在稳定表达GFP-Bax的SW480细胞中,MnSOD活性类似物MnTMPyP能抑制亚硒酸钠诱导的Bax激活,而GSH前体NAC和GSH耗竭剂BSO两种化合物在促进亚硒酸钠诱导的ROS水平升高的同时也促进Bax激活。在寻找亚硒酸钠诱导Bax激活的线索过程中,我们发现通过氧化应激使Bim表达上调可能是Bax激活的机制之一。除此之外,我们进一步利用Biotin标记的巯基修饰剂检测Bax氧化还原状态发现,亚硒酸钠在SW480细胞中能诱导Bax自由巯基氧化,而MnTMPyP能抑制Bax巯基氧化。这些现象提示亚硒酸钠可能通过内源性ROS直接改变Bax的氧化还原状态,其中半胱氨酸的修饰可能发挥了关键作用。利用定点突变技术,我们构建了Bax序列上两个保守半胱氨酸位点突变的表达载体（C62/126S GFP-Bax）,并与野生型GFP-Bax一样在SW480细胞中稳定表达,实时比较野生型和突变体Bax对亚硒酸钠反应的差别。62/126位半胱氨酸突变抑制了亚硒酸钠和H2O2诱导的Bax构象变化、迁移至线粒体、多聚体形成和细胞色素C释放,但不能抑制DNA拓扑酶抑制剂Etoposide和Camptothecin诱导的Bax激活和细胞色素C释放。这些结果提示亚硒酸钠可能通过内源性ROS介导改变62/126位半胱氨酸的氧化还原状态,诱导Bax构象变化而使其激活。5-10μM亚硒酸钠在体外虽能显著诱导结肠癌细胞凋亡,但对原代培养的人胚胎肠粘膜上皮细胞凋亡诱导作用较弱。进一步我们建立了结肠癌动物模型,在整体动物水平观察亚硒酸钠对结肠癌的作用。将SW480细胞接种至裸鼠背部构建结肠癌移植瘤模型,并用亚硒酸钠处理后发现2mg/kg/d的亚硒酸钠能抑制结肠癌移植瘤生长,而对小鼠体重及一般情况影响不大;TUNNEL法检出亚硒酸钠处理组细胞凋亡水平高于对照组;提示超营养剂量的亚硒酸钠在体内情况下可能具有选择性杀伤肿瘤细胞的能力。综上所述,细胞凋亡不仅是解释亚硒酸钠化学预防作用的重要机制,也为其在结肠癌化学治疗的应用可能性上提供了初步的依据。
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