饼粕蛋白酶解产物对异育银鲫生长发育影响及其生物效价分析的研究

论文题目: 饼粕蛋白酶解产物对异育银鲫生长发育影响及其生物效价分析的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 水产养殖学

作者: 刘文斌

导师: 王恬,夏德全

关键词: 饼粕蛋白酶解物,生物效价分析,异育银鲫,生长发育,分子机制

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物蛋白酶解后会产生活性肽类，活性肽不仅有营养作用，而且能促进动物生长、提高免疫机能、增强抗病能力等。本研究选用饼粕植物蛋白作为酶解底物，以几种内切蛋白酶类对饼粕植物蛋白进行酶解，对其蛋白酶解产物生物效价进行分析，并将其酶解产物添加到饲料中喂养鱼类，探讨蛋白酶解产物对鱼类生长发育的影响及其影响机制，为植物蛋白酶解产物开发与应用提供理论依据。1、酶解豆粕蛋白适宜酶类及其酶解条件筛选通过正交试验设计（L9（34）），分别对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和As1.398枯草蛋白酶等三种酶解大豆粕的水解条件中的PH、温度、时间、酶浓度进行了适宜范围的筛选。试验共分27组，酶解结束后分别对27组酶解产物SDS-PAGE电泳分析和水解度测定，并以水解度为衡量指标，对三种酶解大豆粕的水解条件筛选结果表明：木瓜蛋白酶水解大豆粕的最佳条件为：PH7.0、温度60℃、时间5h、酶浓度5％，在此条件下，大豆粕的水解度可达到3.67％；胰蛋白酶水解大豆粕的最佳条件为：PH7、温度50℃、时间7h、酶浓度5％，在此条件下，大豆粕的水解度可达到5.53％；As1.398蛋白酶水解大豆粕的最佳条件为：PH 6.5、温度50℃、时间7h、酶浓度5％，在此条件下，可使大豆粕的水解度达到8.73％。因此，在这三种酶种以As1.398枯草蛋白酶对豆粕酶解能力最强。2、常见几种饼粕蛋白酶解产物的超滤与电泳比较分析用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Asp1.398枯草蛋白酶酶解豆粕、棉粕、菜粕和花生粕，采用超滤法结合SDS-PAGE电泳法对其酶解产物进行分析，结果表明：Asp1.398枯草蛋白酶酶解豆粕效果最好，其次是胰蛋白酶，木瓜蛋白酶最差，豆粕水解度越大的，其低分子量的蛋白质与肽类等物质越多，水解度为5.68％，30KD以上占73.09％，10KD-30KD占2.75％，3KD-10KD占13.42％，3KD以下10.75％；水解度为8.73％，30KD以上占44.87％，10KD-30KD占8.83％，3KD-10KD占14.63％，3KD以下31.67％；而原料蛋白未水解，30KD以上占94.12％，10KD-30KD占3.06％，3KD-10KD占1.86％，3KD以下只有0.97％。在相同条件下，Asp1.398枯草蛋白酶对豆粕蛋白酶解程度最高，10KD以下的小分子蛋白质和氨基酸总比例为46.3％，其次为棉粕25.13％，花生粕和菜粕较小，分别为13.38％和12.58％。这在SDS-PAGE电泳图谱中也能反映出来，其水解度越大，蛋白带越少。3、植物蛋白酶解产物对小鼠胚胎成纤维细胞生长的影响用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、As1.398枯草蛋白酶分别对豆粕、棉粕、菜粕和花生粕等四种植物蛋白进行酶解，用酶解产物对小鼠胚胎成纤维细胞进行培养试验研究，探讨不同酶解产物的蛋白质组分对细胞生长的影响。结果表明，各种酶解产物对小鼠胚胎成纤维细胞的生长都有促进作用，而棉粕的As1.398枯草蛋白酶酶解产物对小鼠胚胎成纤维细胞促生长效果最好。其对小鼠胚胎成纤维细胞促生长速度比豆粕、菜粕和花生粕酶解产物都快，且差异显著（P＜0.05）。4、饼粕蛋白及其酶解物对鱼类肠道微生物体外培养的影响用平板法从健康鱼类肠道中分离得到三种不同的微生物：大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌，再用液体培养法研究了四种植物性蛋白及其酶解物在体外对这三种微生物生长的影响。结果表明，除菜粕原料蛋白外，棉粕、豆粕、花生粕等原料蛋白及棉粕、豆粕、菜粕、花生粕等蛋白酶解物对芽孢杆菌、乳酸杆菌促生长作用明显，差异均显著（P＜0.05）；除棉粕酶解物对大肠杆菌有促生长作用外，四种原料蛋白及其酶解物对大肠杆菌的促生长作用均不明显，差异不显著（P＞0.05）。5、饼粕蛋白酶解产物对异育银鲫生长和免疫指标的影响以基础日粮为对照，将棉粕、菜粕、豆粕、花生粕的酶解物和鱼粉添加于异育银鲫饲料中，喂养61天，结果表明：试验各组异育银鲫增重率与对照组相比均有提高，饵料系数也相应下降，添加棉粕酶解物组增重率最高，与对照组相比提高32.13％，且差异显著（P＜0.05），其它各组增重率比对照组分别提高了3.67％、5.83％、12.17％、11.66％，但差异不显著（P＞0.05）。棉粕酶解物组的酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶活力与对照组相比有显著提高（P＜0.05），其它各试验组的超氧化物歧化酶（SOD），酸性磷酸酶（ACP），碱性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（UL）的活力与对照组相比的活力均无显著差异。在以上几个试验中，通过对饼粕蛋白酶解产物的化学分析和生物效价分析得出初步结论，棉粕的枯草蛋白酶酶解产物的小肽数量和生物效价均较高，所以在以下两个试验中，我们进一步对棉粕酶解产物进行高效液相分析及其对异育银鲫生长发育、消化机能和胰蛋白酶基因表达量的研究，探讨蛋白酶解产物对鱼类的影响效果和作用机制。6、棉粕蛋白酶解产物组份的凝胶层析和HPLC分析通过常规测定、凝胶层析、高效液相色谱等三种方法，测定和分析了棉粕及其As1.398枯草蛋白酶酶解产物的蛋白质组份，并进行比较研究。结果表明：棉粕经过枯草杆菌蛋白酶酶解后，可溶性蛋白比例比原来增加了1倍，游离氨基酸的含量是原来的3.9倍；棉粕原料和酶解后的蛋白质产物经过SephadexG-50、SephadexG-25凝胶层析分离后均得到两个主要蛋白峰，期分子量均超过6000KD，但酶解物的两个峰所含蛋白量均比原料中多；用高效液相色谱法分析可知棉粕原料含有较多大分子蛋白，而酶解物中大分子蛋白含量下降了7.71％，小肽（2-10肽）的含量由27.04％增加到66.78％，游离氨基酸的含量也增加较多。由此可见，棉粕蛋白酶解后能产生丰富的肽类物质，小肽及游离氨基酸的增加有利于动物机体的直接吸收利用，能更快地促进动物的生长发育。7、棉粕蛋白酶解物对异育银鲫消化、生长和胰蛋白酶mRNA表达量的影响为了探讨棉粕蛋白酶产物及添加量对异育银鲫生长，消化蛋白酶活性及胰蛋白酶mRNA表达水平的影响，并研究鱼类生产性能及各项生化指标与蛋白酶活性之间的相互关系。本研究以棉粕蛋白酶解底物，用枯草杆菌蛋白酶对其进行酶解，以酶解产物的混合物1.5％和3.0％两个梯度等量替代鱼饲料中棉粕在室内流水养殖系统中喂养异育银鲫鱼种（体重30±2g）65天。测定鱼类的生长，营养物质表观消化率、消化蛋白酶活性及肝胰脏中蛋白酶mRNA表达水平等指标。结果表明：添加1.5％和3.0％棉粕酶解产物两组鱼类在饲养35天后的增重率分别比对照组高8.96％和44.24％，且差异显著（p＜0.05），在饲养65天后，两组增重率分别比对照组高33.19％和69.62％，且差异显著（p＜0.01），肝胰脏中蛋白酶mRNA表达水平也相应提高，并且以3.0％添加梯度的效果最好（p＜0.05），表明鱼类的生长与消化蛋白酶mRNA表达水平相关，同时棉粕蛋白酶解物对肠道蛋白酶的活性和营养物质表观消化率都促进作用，这可能是棉粕蛋白酶解物的对鱼类生长调控机制之一。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

第一篇文献综述

第一章肽的营养研究进展

第二章饼粕蛋白营养价值评价与在动物生产应用

第三章蛋白质酶解产物生物活性作用及分析方法

第四章鱼类消化酶活性调控、基因表达及其研究方法

参考文献

第二篇研究报告

第一章饼粕酶解酶类及其最佳酶解条件的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章几种饼粕蛋白酶解产物的超过滤与电泳分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章饼粕蛋白酶解产物对小鼠胚胎成纤维细胞细胞培养的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3、小结

参考文献

第四章饼粕蛋白酶解产物对鱼类肠道微生物生长的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第五章饼粕蛋白酶解产物对异育银鲫生长与免疫影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第六章棉粕蛋白酶解产物高效液相(HPLC)分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第七章棉粕蛋白酶解产物对异育银鲫生长、消化与胰蛋白酶基因表达影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢

攻读学位期间发表论文目录

附图

发布时间: 2006-10-20

饼粕蛋白酶解产物对异育银鲫生长发育影响及其生物效价分析的研究

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