论文摘要
NDRG基因家族是近年来新发现的一族基因。该家族有4个成员:NDRG1-4。其中,NDRG2基因编码371个氨基酸和357个氨基酸两个亚型,二者差别在于N-端的14个氨基酸:EAELAARILLDQGQ。NDRG2（357）是我们课题组首先发现的一个在肿瘤组织和细胞中低表达的新基因。关于这个家族的初步研究表明:该家族参与了细胞分化,个体器官的发育及应激反应,并具有抑制肿瘤的增殖与转移的功能。我们对于NDRG2（357）功能的研究表明:NDRG2（357） mRNA的水平高低与细胞的增殖能力呈负相关。过表达NDRG2（357）可抑制胶质瘤细胞增殖。但到目前为止,对于NDRG家族到底如何在细胞中发挥作用仍然不十分清楚。我们利用生物信息学的方法对其基因结构及其编码蛋白也进行了多项分析,未现任何功能结构域。对于功能未知的新基因,寻找与之相互作用分子是研究其功能的重要策略。为进一步研究NDRG2的功能,前期我们课题组的张璟博士以NDRG2（357）为诱饵,利用酵母双杂交方法筛选成人脑cDNA文库,发现MSP58（58-KDa microspherule protein）能够与NDRG2（357）发生相互作用,并在体外和体内进行了验证。在本部分实验中,我们以NDRG2（371）为诱饵,利用酵母双杂交方法筛选胎脑cDNA文库,寻找与之相互作用的分子。最终得到12个具有正确读框的克隆。经blast核苷酸相似性分析,12个克隆代表了9中基因。随后,我们在酵母中再次验证了NDRG2（371）与12个阳性克隆的相互作用。同时,利用哺乳动物双杂交系统在HEK293细胞中进一步验证这一相互作用。在这9个基因中,我们重点对Na+/K+ ATPaseβ1与NDRG2（371）的相互作用进行研究。同时构建了两个分子的截短体,通过共转酵母,确定了NDRG2（371）141-272aa是相互作用所必需的,β1的244-304aa是发挥相互作用必需的。最后通过免疫共沉淀证明了NDRG2（371）和β1在细胞内也存在相互作用。酵母双杂交技术适合研究两个蛋白直接、瞬时相互作用,但是相互作用并不只是存在于两个分子之间。蛋白在执行功能时可能是以复合物的形式存在。TAP（Tandem affinity purification）方法与质谱技术联用更适于研究相互作用的蛋白复合物,因为这种方法不但可使得相互作用的蛋白质以复合物的形式被纯化出来,还可使这些蛋白复合物的组份、定位及转录后修饰保持在自然状态下。因此,这两种方法在研究蛋白质相互作用方面是理想的补充。为研究NDRG基因家族的相互作用分子,我们包装了所有NDRG家族成员C末端融合表达TAP标签的腺病毒载体,建立了特异的用于寻找NDRG家族成员相互作用分子的哺乳动物细胞TAP系统。综上所述,本研究首次用酵母双杂交的方法筛选并获得了12个与NDRG2（371）具有相互作用的分子,并对其中的Na+/K+ ATPaseβ1进行了深入研究,证实了两个分子之间的物理相互作用及其相互作用部位。其次,为了补充酵母双杂交的结果,我们建立了特异的用于寻找NDRG家族成员相互作用复合物的哺乳动物TAP系统,为进一步用TAP方法寻找NDRG家族成员相互作用蛋白奠定了基础。